1、腐乳发醇过程中大豆异黄酮构型和含量的变化糨油加玎 7rc|1sOILAFOOPROSSIW6?食品科技?腐乳发醇过程中大豆异黄酮构型和含量的变化张晓峰李里特殷丽君王家槐辰巳英三.齐藤昌义.(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院2.北京市王致和食品厂 3.日本国农林水产省国际农林水产研究中心)【摘要】研究了 6%,10%食盐含量的腐乳发酵过程中大豆异黄酮构型和含量的变化.结果表明,食盐含量和 B 一葡萄糖甙酶活性与腐乳发酵过程中大豆异黄酮的构型转化密切相关.酶的活性在毛坯发酵 24h 后开始快速增长,在腌制 2d 时达到最高值 102.60U/g.【关键词】腐乳;发酵;食盐;大豆异黄酮;B 一
2、葡萄糖甙酶中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文章编号:10091807(2004)10005803腐乳作为一种传统大豆发酵食品,其功能性质的研究还不充分.长久以来腐乳仅被局限于作调味品使用,产品附加值低,适用范围狭窄.本研究深入探讨了腐乳发酵过程中异黄酮构型和含量的变化,并将低盐腐乳(含盐量 6%)与传统腐乳( 含盐量 10%)进行了对比 ,以期改进腐乳的传统加工工艺,生产高甙元含量的腐乳产品,为解决人体对大豆异黄酮的需求提供新的途径.1 材料与仪器1.1 试验材料菌种:雅致放射毛霉 CICC3118:中国工业微生物菌种保藏中心;大豆:东北黑土地有限公司;大豆异黄酮标准品:SIGMA
3、 出品;牛肉蛋白胨:北京双旋微生物培养基厂;无水葡萄糖:北京瀛海精细化工厂;琼脂粉:北京奥博星生物技术责任有限公司;可溶性淀粉:成都市彭县立春化学厂;麦芽糖:北京化学试剂公司;饴糖:北京饴糖厂;高效液相色谱检测所用试剂均为色谱纯,水为超纯水;其他试剂均为分析纯;熟石膏,粉精盐,食用酒精,香辛料,面黄,红曲:均为市售.1.2 试验仪器FDU 一 506 型真空冷冻干燥机:日本东京理化器械株式会社;GL 一20B 型冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;MILIQSIMS 一 700 超纯水机:日本 lJ 承株式会社;LC 一 10A系列高效液相色谱仪包括:LC 一10AT 溶剂输送泵(2 台),C11
4、C)一10AVP 柱温箱,X3U 一 12A 自动脱气机,SPD 一 10AVVP 紫外检测器,SCL 一 10AV 系统控制器和 CR8A积分仪.2 试验方法2.1 腐乳的制造2.1.1 孢子悬浮液的制备固体斜面培养:雅致放射毛霉在麦芽汁斜面培养基上 30恒温培养 5d(菌种在 4C 保藏,下次使用时还需重新活化).饴糖黄泔水培养基:取饴糖加入黄泔水配成 78.Be 糖液,然后粮油加工与食品机械2004 年第 1O 期在 100mL 液体中加入蛋白胨 1.5g,琼脂 2.0g,自然 pH 值.经过上述两步扩大培养后,将致密的菌丝经胶体磨处理,制备成孢子悬浮液.2.1.2 腐乳白坯的制造大豆经
5、筛选,浸泡,磨豆,滤浆,煮浆,石膏点浆,蹲脑,上榨成型,降温后切块使之成为 5crnX5crnX2cm 的白坯 .2.1.3 腐乳前酵的操作将腐乳白坯接种配制好的孢子悬浮液,摆笼后,在 28,相对湿度大于 90%的条件下培菌.48h 后,白坯表面布满菌丝,经搓毛后,即为腐乳毛坯.2.1.4 腐乳盐腌的操作将毛坯放入腌制罐中,加入15%w/w)的浓盐水 ,每天更换浓盐水两次,共腌制 5d.2.1.5 腐乳后酵的操作将腐乳盐坯捞起,沥干,装入400mL 容量的腐乳专用玻璃方瓶中,每瓶装毛坯 8 块,按质量比 6/9 和10/5 加入无盐后酵汤料,用瓶盖拧?食品科技?粮油工紧瓶口,放入 25的恒温培
6、养箱中进行腐乳后酵成熟.2.1.6 腐乳发酵过程中的取样方法白坯直接取 12 块;毛坯分别在发酵 12h,24h,36h,48h 后取样 12块;盐坯分别在腌制 1d,2d,3d,4d,5d 后取样 12 块;腐乳后酵阶段50d 内,每隔 5d 任选 2 瓶倒出其中汤汁,每次取样 12 块.2.2 腐乳发酵样品中异黄酮的提取样品一真空冷冻干燥 72h 一粉碎机磨至 80 目一取 1g 粉样,加入 80%(v/v)乙醇提取液 40mL 索氏提取6h,80一将提取液定容一取少量上清液经 0.45tzm 滤膜过滤一转入HPLC 专用小瓶备用 .2.3 大豆异黄酮高效液相色谱(I,LC)分析色谱柱:L
7、ichrosper100RP 一 18(4.6mm250ram5/tino流动相:0.1%(v/v)乙酸的水溶液(溶液 A),0.1%(v/v)乙酸的乙腈溶液(溶液 B).溶液 B 在 050min 内由 15%线性递增至 35%.流量:1mL/rain;柱温:40;进样量:20tL; 检测波长:254nm;灵敏度:0.020AUFs.2.4J3 一葡萄糖甙酶活性的测定采用改进的 MatsuuraandObata方法,以 pNFY5 为水解底物测定酶的活性.取 2mLPNPG 液在 45水浴中保温 5min,然后加入 0.5mL的酶液,在水浴中反应 10min 后加入2.5mL1M 的碳酸钠终
8、止反应.将反应液稀释至适当浓度后立即在 400nm下测 OD 值.将 PNPG 液先溶于 0.1M,pH值 4.5 的磷酸盐缓冲液中制成 lmM的溶液.以 1060tM 的对硝基苯酚作标准曲线.1 个酶活单位定义为在上述条件下释放 1tmaol 对硝基苯酚所需的酶量.2.5 食盐含量的测定AgNO3 滴定法.3 结果与讨论3.1 食盐含量对腐乳发酵过程中 J3一葡萄糖甙酶活性的影响由图 1 可以看出:白坯的 J3 一葡萄糖甙酶活性为 6.25U/g,由于没有霉菌生长,所测得的是白坯本身所存在的内源性 J3 一葡萄糖甙酶的活性.毛坯发酵过程中,J3 一葡萄糖甙酶活性升高缓慢.毛坯发酵 24h 后
9、酶的活性开始快速增长,说明此时毛坯表面生长的毛霉在发酵过程中产生大1画彝兰暑基基星霹头易易基按曩发曩发爱卜样品名图 1 腐乳发酵过程中 B 一葡萄糖甙酶活性的变化量的外源性 J3 一葡萄糖甙酶.在腐乳腌制阶段,毛坯浸泡在浓盐水中,食盐开始进入毛坯.腌制阶段,J3 一葡萄糖甙酶的活性继续增加,但是增加的速度趋缓,J3 一葡萄糖甙酶活性在腌制 2d 时达到最高值 102.60U/g;之后酶的活性开始下降.腐乳后酵阶段,盐坯分别加入一定比例的无盐汤汁,其中的食盐含量逐渐降低,J3 一葡萄糖甙酶的活性有所提高.6%食盐含量的腐乳中酶活性提高更快更多,在后酵 20d 达到局部峰值;106食盐含量的腐乳中
10、酶活性在后酵 5d达到局部峰值.其后 6%和 10%食盐含量的腐乳的 J3 一葡萄糖甙酶活性缓慢下降并趋于稳定,分别保持在22U/g 和 18U/g.可以说明:J3 一葡萄糖甙酶具有一定的耐盐性.在腐乳发酵过程中,食盐含量对 J3 一葡萄糖甙酶活性的影响显着,6%食盐含量更有利于提高其活性.3.2 食盐含量对腐乳发酵过程中daidzin 构型和含量的影响由图 2 可以看出:白坯中的异黄酮主要是以糖甙形式存在,daidzein的含量很少.由于毛霉在生长过程中产生大量的外源性 J3 一葡萄糖甙酶,毛坯中 daidzin 迅速分解,daidzein 的含量上升.腌 NI,-JJ3D 入高食盐含量对酶
11、有抑制作用,同时由于食盐的加入图 2 腐乳发酵过程中 daidzin 和daidzein 含量的变化使得固体含量增高,表现在含量上糖甙和甙元都有所降低.在后酵过程中,无盐汤汁的加入使得食盐的浓度降低,酶的活性开始提高,后酵阶段样品中的 daidzin 不断减少,daidzein的含量又开始上升.随着部分食盐渗入汤中,使得固体中食盐含量减少,daidzein 的含量上升 ,66,10%食盐含量样品中的 daidzein 分别在后酵20d,25d 时达到峰值,说明 10%食盐含量对发酵过程中 daidzin 的酶解有较大的抑制作用,延长了酶解时间.6%,10%食盐含量样品中的daidzin 在后酵
12、 30d 时开始检测不出,daidzein 的含量趋于稳定 .3.3 食盐含量对腐乳发酵过程中genistin 构型和含量的影响由图 3 可以看出:genistin 在腐乳发酵过程中酶解的趋势与 daidzin400,三 100500卜样品名图 3 腐乳发酵过程中 genistin 和genistein 含量的变化粮油加工与食品机械2004 年第 10 期噩口.口 000000 蚰弱巧加一峰彝 6/r1 一知匿枢呔相似.白坯中 genlsteln 的含量很少.毛坯中随着 genistin 含量的不断减少,genistdn 的含量迅速上升.盐坯中 genistin 和 genlsteln 的含量
13、都有所氏.6%,10%食盐含量样品中的genistein 在后酵 20d 时达到峰值,但是 6%食盐含量样品中的 genistln 在后酵 20d 时就已经检测不出,而 8%食盐含量样品中的 genistin 在后酵40d 时才检测不出,这说明食盐对发酵过程中 genistln 的酶解的抑制作用更加强烈.3.4 食盐含量对腐乳发酵过程中glycltln 构型和含量的影响50?誉 40一 6%盐分一 10%盐分一 6%盐分 一 10%盐分.甍蕊蓉蓊蔫藏嘉样品名图 4 腐乳发酵过程中 ydtin 和glycitein 含量的变化由图 4 可以看出:与 daidzin 和genistin 相比,gl
14、ycitin 在白坯中的含量很低,仅有 44.86t*g/g 干物质.腌制 3d 的样品中 glycitln 已经检测不出.glycltein 在白坯中检测不出,其含量在前酵 48h 达到最高值.glycitein 含量在腌制第 4 天达到局部峰值 23.80/,g/g 干物质,之后开始趋于平衡.腐乳发酵过程中 glycltin构型的转化非常迅速,食盐含量不同对构型转变的影响没有表现出来.4 结论(1)腐乳发酵过程中,大豆异黄酮的构型转化与 B 一葡萄糖甙酶密切相关,其中起主要作用的是毛霉在发酵过程中产生大量的外源性 B 一葡萄糖甙酶.酶的活性在毛坯发酵 24h 后开始快速增长;在腌制 2d
15、时达到最高值 102.60U/g,食盐含量对口一葡萄糖甙酶活性的影响显着.后酵阶段,6%食盐含量的腐乳中酶活性提高更快更多,在后酵 20d 时达到局部峰值;10%食盐含量的腐乳中酶活性在后酵 5d 达到局部峰值.其后 6%和 10%食盐含量的腐乳的 B 一葡萄糖甙酶活性缓慢下降并趋于稳定,分别保持在 22U/g 和 18U/g,(2)genistln,daidzln 的酶解趋势相似.但是在 6%食盐含量下,genistin 比 daidzin 的未检出时间要早,genistln 约在后酵 20d 时就分解完全.这说明食盐含量对不同糖甙酶解的影响是不同的,对 genistin 的酶解影响更大,降低食盐含量更有利于genistin 的酶解.(3)glycltin 在白坯中的含量很低,仅有 44.86g/g 干物质,腌制3d 后几乎完全转化.白坯中检测不出 glycitein,其含量在前酵 48h 时达到最高值 26.32#g/g 干物质,在腌制第 4 天达到局部峰值 23.80/*g/g 干物质.腐乳发酵过程中 glydfin 构型的转化非常迅速,食盐含量不同对构型转变的影响没有表现出来.参考文献1ZubikL,MeydaniM.Bioavailabilityof
