1、1土传病害生防菌哈茨木霉 FJAT-9040 的绿色荧光蛋白基因转化及其在土壤中的存活能力示踪 1肖荣凤，刘波*，史怀，张衡宇，朱育菁（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003）摘 要：利用PEG-CaCl 2介导的原生质体转化体系，将绿色荧光蛋白基因转入至哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌株FJAT-9040中。从所获得的转化子中选择了1株荧光强且性状稳定的菌株FJAT-9295跟踪分析了该菌株在不同生境类型土壤中存活能力，同时比较了其在有植株及无植株土壤中的存活能力差异。研究结果表明：就处理不同时间而言，菌株FJAT-9295在不同类型的土壤中随着
2、时间的延长，菌落数逐渐下降；前8天处于一个波动状态，16-64天时土壤中菌落数基本趋于稳定，下降了约1个数量级，仍能维持在10 5 CFU/g。就不同土壤类型而言，育苗土最适宜该菌株的存活，其次为沙土及菜园土，而山坡黄土最不利于该菌株的存活与定殖。在处理的前8 天，菌株FJAT-9295在种植植株的各类型土壤中菌落数均显著高于未种植株的各类型土壤，但16-64天期间，两者的菌落数差异不明显。关键词：哈茨木霉，绿色荧光蛋白基因，土壤类型，存活能力Transformation of biocontrol agent, Trichoderma harzianum strain FJAT-9040,
3、with the green fluorescent protein gene (gfp) and its survivability in the different type soilsXIAO Rong-feng, LIU Bo*, SHI Huai, ZHANG Heng-yu, ZHU Yu-jing,(Institute of Agrobiological Resources, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)Abstract: Trichoderma harzianum strain FJ
4、AT-9040 had been transformed with gene coding for green fluorescent protein (GFP) by using protoplast-mediated genetic transformation system. A transformant, FJAT-9295, with strong fluorescent expression was chosen to visualize the survivability in the different type soils. Simultaneity, the 收稿日期： 作
5、者简介：肖荣凤（1977 -），女，硕士，助理研究员，从事植物病理学研究。通讯作者：刘波（1957 -），男, 研究员, 从事农业微生物技术与农业生物药物研究（E-mail: )。 基金项目：公益性行业（农业）科研专项（200903049）, 福建省属公益项目（2010R1020-6）, 福建省杰出青年科学基金，2009J060102survivability of stain FJAT-9295 was compared between the soil with plants and without plants. The results showed the colony populat
6、ions decreased gradually during 64 days in the different type soils, and the populations kept fluctuating up and down 8 days after inoculation. However, they kept stabilization from 16d to 64d and were above 105 CFU/g in the soils. For the different type soils, the best survivability for the strain
7、was in the soil with planting seedling, in turn, soil in filed, sand and yellow soil from hill. Then, the survivability of the strain in the soil with host plants showed that the colony population was higher than that without plants 8 days post inoculation, but it had no distinctness different from
8、16 to 64 days.Key words: Trichoderma harzianum, Green Fluorescent Protein gene, soil types, survivability木霉（Trichoderma spp）对植株不具致病性，但对许多植物病原真菌具有很强寄生或拮抗作用，如镰刀菌属（Fusarium）, 疫霉属（Phytophthora）, 核盘菌属（Sclerotinia ）, 丝核菌属（Rhizoctoniaand ）及腐霉菌属（ Pythium）等属的病原菌，因此被广泛作为生防菌 1-2。Harman等研究认为，一些根际定殖能力强的木霉能随着植物根的
9、生长而在根表面定殖，利用这种强致病力的木霉菌株处理种子，不仅能保护种子还能保护随后长出的根苗 2。Vinale 等 3通过温室与田间试验均表明哈茨木霉（T. harzianum ）T22和深绿木霉（T. atroviride ）P1能促进多种植物的生长；Bernal-Vicentet等 4的研究表明哈茨木霉能有效地防治甜瓜枯萎病；王革等 5用长枝木霉防治烟草黑胫病，温室防效达97.16% ；赵国其等 6用绿色木霉Ta处理西瓜幼苗，不仅能抑制病菌生长，还能增强瓜苗长势。已商业化的木霉制剂主要被用作生物杀菌剂、生物肥料及土壤改良剂 2, 7。目前全球已经有50多种木霉商品化制剂 8，如以色列的Ma
10、khteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂(Trichodex) 9、美国的Root shieldTM10和Topshield ( T. harzianum T222菌株) 11、中国的绿色木霉制剂“ 特立克 ”12。虽然许多研究证实了木霉菌具有较好的生物防治效果，但目前真正用于生产的木霉制剂还不多，因为生防菌的应用长期以来一直面临效果不稳定的问题。彭可为和李婵 13也提出在生物防治中，生防制剂迄今仍有两大难题没有解决：一是田间接种效果不稳定，且随土壤类型的不同有很大差异；二是所接菌株的存活量难以达到要求。木霉菌作为生防菌应用于植物病害的防治，目前更多的是集中于
11、木霉菌-植物-病原菌间的互作关系 14，因此，更好地了解其在土壤微生态系中存活与繁殖能力，才能使其更有效地发挥其生防的功效。 本研究利用绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 基因对哈茨木霉进行转导标记，由于它们具有稳定、直观、操作方便的荧光性质和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点，已经被转化到许多病原菌和生防菌中 15-19。利用转导GFP的木霉菌研究在不同类型土壤中的生存能力，对于木霉菌用于生防具有重要意义，相关研究未见报道。本研究的目的是利用gfp基因标记对 尖孢镰刀菌具有较强拮抗作用的哈茨木霉菌株FJAT-9040，并利用标记
12、后的菌株并跟踪观察其在不同类型土壤中存活能力，同时比较了哈茨木霉菌株在寄主植物种植条件下及未种植株的土壤中的定殖动态差异，为菌株FJAT-9040更好地选择作物防治对象，发挥最佳的防治效果提供理论依据。31材料与方法1.1 供试材料菌株：哈茨木霉菌株 FJAT-9040 由本研究室从田间土壤经单孢分离获得并保存，在潮霉素 B 浓度为 300 g/mL 的 PDA 培养基不生长。质粒：质粒 pCT74 由美国 Oregon 大学 Ciuffetti 博士惠赠，含有真菌 Pyrenophora triticirepentis 的 ToxA 启动子和潮霉素 B 磷酸转移酶基因（hygr），已被应用于
13、 8种植物病原真菌 20。供试土壤：育苗土（厦门市银龙种苗有限公司购买） 、菜园土（采自福建同安郭山茄子种植地） 、沙质土（采自福建农林大学沙滩） ，山坡黄土（采自福建同安郭山） 。供试植物：15-20cm 大小的茄子实生苗。1.2 方法1.2.1 原生质体制备及形成过程参照文献肖荣凤等 19的方法，但略作修改。接有菌株 FJAT-9040 的孢子悬浮液的 PD 培养液在28 、150 r/min 摇床培养 12-14 h 后用三层擦镜纸过滤收集菌丝，并用 0.8 mol/L 的 NaCl 充分洗涤后，取 600 mg 菌丝体加入 2mL 裂解液（包含 20 mg/mL 崩溃酶，购自 Sigm
14、a 公司和 20 mg/mL 溶壁酶，购自广东微生物所） ，28 、70 r/min 消化 4 h 左右。用三层擦镜纸收集滤液，室温 3500 r/min 离心 10 min，弃上清液加 10 mL STC（含 1.2 mol/L 山梨醇、10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmol/L CaCl2）溶液5000 r/min 离心 10 min，弃上清，调整原生质体浓度约为 107 个/mL。1.2.2 菌株的转化及稳定性检测从LB平板中挑取活化培养24 h的质粒pCT74的单菌落到含有 50 g/L氨苄青霉素抗生素的LB 液体培养基，于37 、300 r/min过夜
15、培养。质粒 DNA提取方法按 Plasmid Mini Kit（QIAGEN ）试剂盒的操作步骤进行。取5 g质粒DNA与 200 mL原生质体在离心管中混匀，室温静置20 min，加入（1-1.25 ） mL 40%PTC（含40%PEG4000 、10Mm Tris-HCl (pH 7.5)、50Mm CaCl2） ，轻轻混匀，室温放置20 min。然后加入到100 mL冷却至50 左右的含 0.9%琼脂再生半固体培养基中（培养基中含 50 g/mLAmp和300 g/mL HmB） ，混匀后倒于底层已覆盖再生半固体培养基（马铃薯200 g、蔗糖182 g、琼脂9 g、水1000 mL）的
16、平板上， 28 倒置培养3-7 天后获得转化子。第一代转化子在普通PDA培养基上重复转接6 代后，观察菌落形态，并挑取菌丝在荧光显微镜下观察菌丝及孢子的荧光强度，并保存性状稳定的转化子。随机选取13 个性状稳定转化子，以野生菌株为对照，采用CTABNaC1法提取菌株的基因组DNA ，利用引用P28(5-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3)/P29(5-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATT CAAT-3) 扩增，目的片段大小约 417 bp。PCR扩增反应程序：94 预变性3 min；94 变性45 s，58 复性1 min，72 延伸 1 min，
17、35 个循环；最后于72 延伸10 min。 PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶图像分析系统观察。1.2.3 哈茨木霉菌株在不同类型土壤中的定殖动态取一株性状稳定的转化菌株 FJAT-9295 液体培养后，过滤后调节孢子悬浮液浓度为 107 CFU/mL。取菜园土、山坡黄土、沙质土和育苗土各 500 g 于盆钵中，分别与 50 mL 孢子悬浮液充分搅拌均匀，使土壤中的孢子数量为 106 CFU/g，60-70%湿度下保湿培养，每处理重复 3 次。同时按4相同方法设另一种植 15-20cm 大小的茄子实生苗的处理。均于第 2 天，4 天，8 天，16 天，32 天和64 天定期取样
18、，取 10 g 土样采用稀释涂板法分离计数，用含有终浓度为 300 ug/mL 潮霉素 B 的 PDA培养基培养 2 天后在体视荧光显微镜下检测发绿色荧光的哈茨木霉菌落数，计算每克土中的菌落数。1.2.4 哈茨木霉菌株在寄主植物种植条件下土壤中的定殖动态试验方法同 1.2.3，比较菌株 FJAT-9295 在寄主植物种植条件下 土壤中的定殖情况，以不种植寄主植物为对照，有植株处理组模拟植株生长过程的土壤环境，无植株处理组模拟田地休耕状态下土壤环境（已去除杂草） ，分析菌株在两种不同环境土壤中的存活能力。2. 结果与分析2.1 原生质体制备及形成过程不同酶解时间原生质体的形成情况如图所示，酶解1
19、h时仅有少量原生质体释放出来（图1-A） ，随后逐渐增多（图1-B，1-C） ，至第（3.5-4 ）h 时大量原生质体释放出来，整个菌丝团均形成原生质生(图 1-D，1-E)。消化4 h过滤所得到的原生质体浓度可达10 8 个/mL，且大小不一、圆球形，符合转化要求的原生质体可达90%以上（图1F ） 。A B5图 1 不同酶解时间原生质体的形成情况（A: 1 h，B: 2 h，C: 2.5 h，D: 3.5 h，E:4 h，F ：过滤后供转化的原生质体）Fig.1 The production for protoplasts of strain FJAT-9040 in the differ
20、ent time（A: 1 h，B: 2 h，C: 2.5 h，D: 3.5 h，E:4 h，F：protoplasts for transformation）2.2 转化子的荧光稳定性分析及 PCR 检测采用 PEG-CaCl2 介导的原生质体转化，每微克质粒可获得 36 个转化子，经过 300 g/mL 潮霉素筛选，随机挑选 50 个发光良好的转化子进行继代培养。不同转化子的菌落颜色略有不同（图 2） ，大部份转化子的菌落颜色与野生型菌株相似，少数转化子的菌落表面颜色呈灰白色（图 2-i，2-j ）至白色（图 2-g） 。转化子在荧光显微镜下的分生孢子梗及分生孢子的荧光强度，均发光良好（图
21、3） 。 以 P28 /P29 为引物，对随机挑选 13 个转化子 DNA 进行 PCR 扩增，结果表明：13 个转化子均扩增出一条 417 bp 左右的片段，而阴性对照未扩增出相应条带（图 4） ，说明该 gfp 基因已经转入到菌株中。C DE F6图 2 菌株 FJAT-9040 的转化子菌落形态Fig.2 Transformants colony morphology of strain FJAT-9040 图 3 A-C 分别为菌丝体（ 400 倍） 、分生孢子梗（400 倍）和分生孢子（400 倍）在荧光下的形态;Fig.3 A-C: The morphology of myceli
22、um(400), conidiogenous cells(400) and conidia (400) under UV-light;respectively.图 4：随机选取的 13 个菌株的 PCR 扩增图谱M：3000 bp 的 Marker；1-13：转化子；14：pCT74；15：阴性对照Fig. 4 The PCR amplification map of the selected 13 transformants at at randomM : 3000 bpMarker; 1-13 : transformants; 14 : pCT74; 15 : Negative contr
23、ol2.3 哈茨木霉菌株在不同类型土壤中的定殖动态试验结果见图 6。就不同时间而言，总体上菌株 FJAT-9295 在不同类型的土壤中随着时间的延长，菌落数逐渐下降。前 8 天处于一个波动状态，至 16 天时菌落数下降了 1 倍以上，16 天至 64天的菌落数基本趋于稳定。就不同土壤类型而言，菌株 FJAT-9295 育苗土中的存活菌落数相对最高，417 bpa b c de f g hi j k lA B C7前 8 天可保持在 7105 CFU/g 以上；其次为沙土及菜园土，前 8 天可保持在 4105 CFU /g 以上；而在山坡黄土中的存活菌落数最少，前 8 天内菌落数约为（2-4）1
24、0 5 CFU /g。但在 16 天之后，在各类型土壤中菌体的存活数量差异不大。0.00E+002.00E+054.00E+056.00E+058.00E+051.00E+062 4 8 16 32 64时 间 （ d）菌落数（个/g）育 苗 土 沙 土 山 坡 黄 土 菜 园 土0.00E+002.00E+054.00E+056.00E+058.00E+051.00E+062 4 8 16 32 64时 间 Time/d菌落数（CFU/g）Colonies(CFU/g)育 苗 土 沙 土 山 坡 黄 土 菜 园 土图 5：菌株 FJAT-9295 在不同土壤类型土壤中的定殖动态 A：未种植植
25、物 B：有种植植物Fig. 5 The populations of strain FJAT-9295 in different type soils A：without planting seedling B：with planting seedling2.4 哈茨木霉菌株在寄主植物种植条件下土壤中的定殖动态试验结果见7。在处理的前8天，菌株FJAT-9295在有植株的各类型土壤中菌落数均显著高于无植株的各类型土壤。但16-64 天期间，在有种植植株与未种植植株的各类型土壤中菌落数差异不明显。到第64天时，菌落数仍能维持在10 5 CFU /g，较原始接菌量下降约1个数量级。0.00E+00
26、2.00E+054.00E+056.00E+058.00E+051.00E+062 4 8 16 32 64时 间 Time/d菌落数（CFU/g）Colonies(CFU/g)无 植 株 有 植 株0.00E+002.00E+054.00E+056.00E+058.00E+052 4 8 16 32 64时 间 Time/d菌落数（CFU/g）Colonies(CFU/g)无 植 株 有 植 株ABBA80.00E+002.00E+054.00E+056.00E+058.00E+051.00E+062 4 8 16 32 64时 间 Time/d菌落数（CFU/g）Colonies(CFU/
27、g)无 植 株 有 植 株0.00E+002.00E+054.00E+056.00E+058.00E+052 4 8 16 32 64时 间 Time/d菌落数（CFU/g）Colonies(CFU/g)无 植 株 有 植 株图 7：菌株 FJAT-9295 在有植株与无植株土壤中的定殖动态（A：育苗土；B：菜园土；C：沙土；D ：山坡黄土）Fig. 7 The populations of FJAT-9295 in the soil with plants or without plants(A：soil for breeding seedling；B：soil in filed; C: s
28、and; D: yellow soil from hill3.讨论生防菌株的在田间的存活与定殖能力是其能否发挥生防作用的一个重要条件。存活与定殖能力强，可以充分发挥其空间、营养竞争和抑制病原菌生长的作用，进而表现出较好的防病效果 21-22。随着分子生物学向微生物生态学的渗透，特别是gfp 基因标记技术的发展与成熟，使它成为研究微生物生态学的一种快速、简便、经济的手段。木霉菌株的绿色荧光蛋白基因转化方面，刘士旺等 23将带有潮霉素抗性标记的激发子基因转到绿木霉（ T. viride）中，使其成为价值更大的生防菌。Bae 和Knudsen 24将GFP、GUS和潮霉素基因导入哈茨木霉，得到一个三
29、种标记稳定的转化子(ThzID1-M3)。Sarrocc 等 25利用转gfp 基因的绿木霉10 观察其对Sclerotium rofsii和Sclerotinia sclerotiorum的菌核的定殖方式。为了跟踪T. harzianum不同几丁质酶的原位表达，Zeiling 等 26 (1999)将gfp 基因整合到 T. harzianum几丁质酶的nag1(编码N-乙酰基-D- 氨基葡萄糖苷酶)和ech42( 编码内切壳多糖酶)基因的5上调控序列上。 Lu等 27用GFP标记的T. atroviride研究了菌株对 Pythium ultimum和Rhizoctonia solani的
30、重寄生现象。本研究在gfp基因标记尖孢镰刀菌的基础上 19，成功地将gfp基因标记到一株对尖孢镰刀菌具有较强的拮抗作用及盆栽防效的木霉菌株FJAT-9040上。通过跟踪不同时间原生质体的形成情况，发现哈茨木霉的菌丝体在2 mL裂解液（包含20 mg/mL崩溃酶和20 mg/mL 溶壁酶） ，28 、70 r/min酶解 4 h左右时，原生质体可满足转化要求。在相同条件下，哈茨木霉菌株的酶解时间较尖孢镰刀菌长1.5 h左右，比较两者的原生质体发现，木霉菌的原生质体外壁较尖孢镰刀菌的厚，且更不易破损。二者的差异可能取决于菌丝的结构不同，木霉菌属于丝孢纲的丛梗孢目，而尖孢镰刀菌属于丝孢纲的瘤座孢目。
31、生防菌株在土壤及根系中的存活与定殖方面，邱珊莲等 28将gfp基因标记的甲基对硫磷降解菌DLLBR 接入青菜根际土壤中，发现标记菌株在土壤中的存活力很高，与对照相比更能促进植株内菌体结构的变化。李金云等 29用gfp标记菌株，跟踪分析了葡萄根癌病生防菌葡萄土壤杆菌E26菌株施到田间后在葡萄根表面和根际土壤中的群体数量变化，接种5个月后，E26在根表面的平均数量为10 4 CFU/g根(鲜重)，在根际土壤中的平均数量为10 4 CFU/g土壤(干重)。Cubeta 等 30将燕麦粉碎后C D9与两株丝核菌属的生防菌232-CG 和 JF-3N1-1混匀后埋入不同的土层，发现1个月后在1 cm的土
32、层中，两株生防菌的数量分别增加了19%和58% ；但是在15-30 cm的土层中分别减少了38%和69%。Longa 等 31利用 real-time PCR观察了生防菌 T.atroviride SC1在葡萄园土壤中的存活能力，接菌18周后，菌株仍保持着较高的浓度，接种1年后在处理区仍可检测到该菌的存在。Jayaraij和Radhakrishnan 32研究了除草剂二甲戊乐灵对哈茨木霉在土壤中的存活能力，表明使用该除草剂能明显降低哈茨木霉的数量。Bennett 33研究了两种生防菌小盾壳霉和枯草芽孢杆菌MBI 600在巴氏消毒土壤、灭菌土壤及未灭菌土壤等3种不同类型土壤的存活能力，结果表明，
33、生防菌小盾壳霉在灭菌与未灭菌的土壤中都能很好的存活，但枯草芽孢杆菌MBI 600在灭菌土壤中存活能力最强，其次是未灭菌土壤，而在巴氏消毒土壤存活能力最差。但是，未见哈茨木霉在不同类型土壤中生存能力的研究报道。本研究选择了1株荧光性状稳定的转子FJAT-9295分析了哈茨木霉菌株在4种不同类型土壤中的定殖动态，结果表明，育苗土最适宜该菌株的存活，其次为沙土及菜园土，而山坡黄土最不利用该菌株的存活。其原因是育苗土质疏松且营养丰富有利用木霉定殖与存活，沙土因较为疏松和菜园土因营养较为丰富也有利用木霉的存活，但山坡黄土因遇水容易板结，容氧量较前3者小，所以不太适宜木霉定殖与存活。因此可推断，木霉制剂在
34、土质疏松的土壤条件下更有利于发挥其对病害的防效。哈茨木霉菌株FJAT-9295在有种植株土壤中的定殖动态结果表明，在处理的前8天，菌株FJAT-9295的菌落数略有下降，但在有种植株的各类型土壤中菌落数均显著高于未种植株的各类型土壤，可能与植株的分泌物刺激有关，提高了孢子的存活能力；16-64天期间，菌落数较原始接菌量下降了约1 个数量级，仍能维持在10 5 CFU /g，但在有种植株与未种植株的各类型土壤中菌落数差异不明显，可能是此阶段木霉菌丝或孢子的繁殖与死亡处于一个相对稳定的状态，或大多以厚垣孢子的形式存在，有利于菌体的存活，相关研究表明，木霉属厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生孢子，至
35、少能存活20 个月 34。Lockwood 35认为许多种类真菌进入土壤后其孢子迅速失去营养，由原来的不需外部营养转变为营养依赖性，因此很容易受到土壤抑菌作用的影响，直到有外部环境提供营养( 包括根渗出物所提供的)来消除这种影响因素。16-64 天时，在种植植株的处理组中部份菌丝或孢子已在植株的根系中及其周围定殖。有关该菌株在植株根系及体内的定殖将有待进一步研究。参考文献（References）1 Hjeljord L, Tronsmo A. Trichoderma and Gliocladium in biological control: an overview. In: Harman,
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