1、肝硬化患者中性粒细胞吞噬及细胞内杀菌功能的研究26 塞医学杂志 2004 年第 20 卷第 1 期肝硬化患者中性粒细胞吞噬及细胞内杀菌功能的研究徐希岳陶荣亚摘要目的:探讨肝硬化患者中性粒细胞吞噬和细胞内杀茵功能 .方法: 采用普通酵母茵对 44 例肝硬化患者及 38 例正常人进行中性粒细胞吞噬和细胞内杀茵功能试验.结果:38 例正常人中性粒细胞吞噬率和杀伤率均值分别为(23 7)%和(39 3)%,44 例肝硬化患者中性粒细胞吞噬率和杀伤率分别为(15 5)%和(307)%,明显低于正常对照组.24 例失代偿期肝硬化患者与 12 例代偿期肝硬化患者,及 8 例肝硬化合并肝癌患者与 36 例肝硬
2、化非合并肝癌患者中性粒细胞吞噬及杀伤功能均无明显差异.结论:肝硬化患者中性粒细胞吞噬和杀伤功能明显减退.关键词吞噬细胞酵母茵肝硬化PhagocytosisandintracellularbacteriocidefunctionofneutrophilsincirrhosisofliverXUXiyue,TAORongya.DepartmentofGastroentianaology,AffilitedHospitalofBengpuMedicalCollege,Anhui,Bengbu230004,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatethephagocyt
3、osisandintracellularbacteriocidefunctionofBeutrophilsin 口 atientswithlivercir.rhosis.MethodsYeastcellswereusedforexaminingphagoeytosisandintracellularbacteriocidefunctionofneutrophilsin44casesoflivercirrhosisand38normalsubectsascontrols.ResultsThemeanvalueofphagocytosisandkillingratesofneutrophilswe
4、re23%7%and39%4-3%respectivelyincontrols,and15%4-5%and30%4-7%respectivelyinthecirrhosis.Thevaletsweresignificantlvlowererinthecirrhosisthanthosecontrols.,butthereWasnosignificantdifferenceamongallkindsofcirrhosis,ConclusionThephagocytosisandintra.cellularbacteriocidefunctionofneutrophilsweresignifica
5、ntlylowerinthelivercirrhsis.【Keywords】 phagocytosisneutrophilsyeastshepaticcirrhosis肝硬化患者的免疫功能减弱,既有体液免疫降低的因素,又有细胞免疫功能降低的因素,而中性粒细胞又是细胞免疫的重要组成部分,为探讨肝硬化患者的细胞免疫功能,笔者对 44 例肝硬化患者中性粒细胞的吞噬及杀菌功能进行了研究,现将结果报告如下.1 资料与方法1.1 一般资料 44 例研究对象均系我院消化科住院肝硬化患者.肝硬化的诊断依据病史或血清学肝炎病毒感染标志阳性,临床症状及体征,肝功能异常和影像学检查佐证而确诊.44 例患者中男 38
6、 例,女 6 例;年龄 1446 岁,平均 42 岁.44 例有肝炎后肝硬化患者,代偿期 12 例,失代偿期 24 例,肝硬化合并肝癌 8例.44 例肝硬化患者白蛋白低于 35g 者 25 例(74%),血清胆红素高于 34.7ttmmol/L 者 7 例(29%).ALT 超过 40U 者 l0 例(27%).24 例失代偿期患者并发食管静脉曲张破裂出血 7 例,食管静脉曲张出血合并肝性脑病 2 例;肝性脑病 2 例.另有正常人 38 例作为对照组,男 31 例,女 7 例,年龄 2861 岁,平均 37 岁.受检者在取血前均未使用抗生素,激素或免疫抑制剂等药物.1.2 方法1.2.1 材料
7、取受验者肘静脉血 2mL,置于肝素无菌管内,立即送验.肝素无菌管内加含肝素 25U/mL作者单位:230004 蚌埠医学院附属医院消化科溶液 3 滴.普通酵母菌作为实验菌.1.2.2 具体方法和步骤如下(1)先将酵母菌置于37下培养 1824h,然后用 Hanks 平衡盐水溶液洗涤 2 次后,计算酵母菌数,涂片后作姬姆萨染色,测定其活力;(2)抽血 2.5mL 置于无菌肝素抗凝管内 ;测定白细胞总数及其中性粒细胞百分数;(3)取 0.2mL 酵母菌 Hanks 平衡盐水溶液 0.8mL 的肝素抗凝全血中,使酵母菌数与中性粒细胞数之比为 2:1,置 37下孵育 1h.吸取自然沉淀的白细胞层制片,
8、姬姆萨染色;(4)计数 100 个中性粒细胞中吞噬的酵母菌数 (包括死菌与活菌).酵母菌杀伤,用细胞死亡后伴随颜色的改变来判定.活菌染成蓝色,死菌不着色或中心和(或)两端出现不着色区 .1.2.3 判定标准(1)吞噬百分率:每 100 个中性粒细胞中吞噬有酵母菌的中性粒细胞数;(2)杀伤率:将100 个中性粒细胞所吞噬酵母菌的死菌数除以 100 个中性粒细胞所吞噬酵母菌总数的百分数.2 结果44 例肝硬化患者中性粒细胞吞噬率范围 6%25%,正常人吞噬率在 2%38%.肝硬化患者中性粒细胞平均吞噬率明显低于正常人.44 例肝硬化患者中性粒细胞杀伤率范围为 3%42%,其中 12 例代偿期患者为
9、 25%38%, 失代偿期患者为 10%36%.8 例肝硬化合并肝癌患者为 26%42%,36 例肝硬化未合并肝癌患者为 3%40%;正常对照组中性粒细胞杀伤率范围为 35%47%.肝硬化患者中医学杂志 2004 年第 20性粒细胞杀伤率均值明显低于对照组.见表 l.表 1 肝硬化患者与正常人中性粒细胞吞噬及杀伤功能试验结果l2 例代偿期患者中性粒细胞吞噬率和杀伤率范围分别为 7%一 24%和 25%38%,失代偿期患者为8%一 24%和 10%一 36%;代偿期与失代偿期患者中性粒细胞吞噬率和杀伤率均值差异不明显(见表 2),但代偿期与失代偿期患者分别与正常对照组相比较,均明显降低(P0.0
10、01).8 例肝硬化合并肝癌患者中性粒细胞吞噬率和杀伤率分别为 6%18%和 26%一42%,36 例肝硬化未合并肝癌患者分别为 7%25%和 3%一 40%,两者问中性粒细胞吞噬率均值亦差异不明显(见表 2),但两组患者分别于正常对照组相比亦明显减低(P0.001).表 2 肝硬化患者与正常人中性粒细胞吞噬及杀伤功能试验结果 4-s本组检测 15 例肝硬化患者免疫球蛋白(IgA) 及10 例 C3 含量,15 例患者 IgA 为(0.430.21)g/L,明显低于正常对照组(2.060.56)g/L.8 例代偿期和7 例失代偿期患者 IgA 均值都为 0.43g/L,两组问差异无显着意义,但
11、均低于正常对照组.l0 例肝硬化患者 C3 含量为(0.690.03)g/L,明显低于正常对照组(1.030.27g/L),其中代偿期 7 例和失代偿期 3 例均为 0.68g/L.3 讨论肝硬化导致肝脏枯否细胞功能异常,以及单核细胞趋化,吞噬和杀伤功能减退.本组研究结果显示肝硬化患者中性粒细胞吞噬及杀菌功能明显低于正常人,而代偿期与失代偿期患者,肝硬化合并原发性肝癌患者其中性粒细胞吞噬和杀菌功能均无差异.肝硬化对单核一巨噬细胞系统功能影响的机制仍不十分清楚,Hassnet 等1认为肝硬化患者单核细胞吞噬及杀菌功能降低与血清中存在一种分子量小于l2000 的可透析的抑制因子有关.也有认为免疫球
12、蛋白(IgA)抑制中性粒细胞趋化性.杀菌活力和吞噬作用;这可能与患者血浆中可溶性免疫复合物,竞争性地27抑制被调理的酵母菌粘附到中性粒细胞的 Fc 和 C 受体上,从而抑制吞噬作用【2,3J.本组肝硬化患者中 l5 例检测 r 免疫球蛋白和 C含量,结果表明 l5 例 IgA 高于正常值,l0 例 C3 含量低于正常值,均有统计学意义.由此推测,本组肝硬化患者中性粒细胞吞噬及杀菌功能异常似乎与 IgA 升高或/和 C3 降低有关.IgA 升高抑制了中性粒细胞吞噬作用或与抗原形成抗原抗体复合物,后者封闭了中性粒细胞 Fc 和 C3 受体,致使被调理的微生物不易被中性粒细胞所吞噬或杀伤.C3b 由
13、 C3 裂解而来,C3 降低必然导致 C3b 减少,后者是重要的调理素;结果酵母菌因C3b 减少而得不到调理,就不易被中性粒细胞吞噬或杀伤.机体感染细菌后,中性粒细胞可通过氧化和非氧化途径吞噬并杀伤细菌.新近研究发现中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶对革兰氏阴性杆菌也有防御作用,而对革兰氏阳性球菌无效.作者将 10 新分离的人中性粒细胞与 cfu 大肠杆菌在孵育后 ,采用免疫电镜技术,以弹性蛋白抗体标记,发现含有大肠杆菌的吞噬溶酶体中,弹性蛋白酶含量增加.106efu 大肠杆菌与 2tlmol/L 孵育 4h,细菌数量明显减少.扫描电镜发现与弹力蛋白酶孵育的大肠杆菌表面粗糙,形态发生明显改变.,透视电
14、镜显示内外墨界限不清,结构发生明显改变;光镜也显示细菌包膜完整性受损,许多细菌已死亡.认为弹性蛋白酶溶解大肠杆菌外膜蛋白 A,可通过破坏细菌的完整性或局部削弱细胞壁而引起渗透性溶解致其死亡.细菌外膜蛋白 A 溶解后,中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶进入细菌内部,引起内部蛋白溶解,起到杀菌作用.最近研究还发现人类中性粒细胞噬苯胺蓝颗粒对夹膜组织胞浆菌具有较强且持久性抑制作用,而且所有抑制真菌活性均存在于噬苯胺蓝颗粒之中.噬苯胺蓝颗粒成份有溶菌酶,弹性蛋白酶,人类中性粒细胞防卫素(humanneutriphildefensin,NHP),蛋白酶 3 等.试验发现人类粒细胞防卫素(NHP1,NHP2,NH
15、P3) 在浓度依赖性的方式下抑制夹膜组织胞浆菌的生长 5.人类粒细胞防卫素,弹性蛋白和杀菌一通透性增高蛋白是人类粒细胞噬苯胺蓝颗粒中能引起对夹膜组织胞浆抗真菌作用的效应分子.中性粒细胞功能主要是防御病原体 6.Nobuhide等通过检测中性粒细胞凋亡证明,肝硬化患者粒细胞寿命缩短.肝硬化时由于脾功能亢进和骨髓造血功能受抑制和寿命缩短,致使其外周血粒细胞数量减少,加之其吞噬和杀菌功能降低,所以笔者认为这是肝硬化患者易于细菌感染的根本原因.提高患者粒细胞数和其防御功能是预防感染的关键.肝硬化免疫功能低下不仅易致细菌感染,而且也是易发生肝癌的一个重要因素,肝硬化患者在肝细胞癌发生前免疫功能低下,28
16、 区堂杂志 2004 年第 20 卷第 1故应引起临床医师的足够重视.proteinAinescherchiac.likilligbyeutr 印hile1astase.sciece,(本研究试验操作部分由原检验科主任刘毓芝协助完成,在此感 2000,289(5482):11851187调.)5NewmanSL,GooteeT,GabayJ,eta11dentifictionofconstiuentshu.4 参考文献 mallneutrophilazurophilgtanule$thatmediatefungistasisagainthisto.1HassnelAVI,KlelterY,Sh
17、lag1),eta1.1mpairedm0nocytefuncti0ninplasmacapsulum.Infectlmmun,2000,68(10):56685672livercirrh0sis.BrMedJ,1981,282(6272):126212636 刘韧.中性粒细胞凋亡与组织损伤的研究进展.国外医学外科学2KempAS,CrippsAW,BrovmS.Suppres8ion0fleucocytechemokinesis 分册,2001,21(9):183185andchemotaxisbyhumalsA.CliExplmmunol,1980,40(2):3887 陈公英.肝炎后肝硬
18、化血液学异常的若干研究国外医学流行病与395 传染病分册,2001,28(4):165 1683CampbellAC,DronfieldNW,ToghillPJ,ela1.Neutr0uhilfunctionin(收稿:20030928 修回:20031130)chronicliverdisease.ClinExplmmunol,1981,45(1):81894BelaaouajAA,KimKS,ShapiroSD,Degradationofoutermembrane胸腹腔积液石蜡制片方法的改进俞友娟沈宝珠陈维杨文君吴翔燕任晓冰我院在实践中摸索出一种简易的胸腹腔积液细胞沉淀物用琼脂包埋法,配合
19、与普通胸腹腔积液涂片对照,现介绍如下.1 材料与方法1.1 材料收集我院 20012002 年间胸腹腔积液样本 20 例.备琼脂糖,800型离心机等.1.2 方法送检新鲜胸腹腔积液标本分成两份,分别放入两个锥形玻璃管内,用1000r/min 速度离心 510min,弃去上清液.取 1 管沉淀细胞作涂片,稍干后固定,苏木精一伊红染色;另一管加入 10%的福尔马林 45mL 左右,放入 4冰箱内 1h,使细胞能与固定液充分接触,固定后离心弃去上清液,PBS 洗 1 次,只留少许 PBS 水以与细胞沉淀物混匀,便于吸取.取 3%琼脂糖 PBS 液微波加热溶解后,吸取适量的琼脂糖滴于载玻片上,冷却至表
20、面稍凝固后用加样器吸取细胞注入琼脂内,即可形成乳白色的细胞团.待完全凝固后,切去多余的琼脂,再按常规脱水,包埋,切片,染色.1.3 统计每张切片和涂片均在细胞密度最高区计数(每 5 个高倍细胞数),计算均数,结果采用 t 检验.2 结果涂片光镜下观察见细胞散在,成群或作者单位:310015 杭州市第二人民医院病理科(俞友娟,陈维,扬文君,吴翔燕,任晓冰);310010 杭州市第一人民医院病理科(沈宝珠)聚集成团状,成群细胞胞浆呈一片不明显的背景,缺乏清楚的细胞边界;部分细胞浆内有大黏液泡,似印戒样;未见明显腺腔结构.涂片细胞有不同程度退变.免疫组化染色,阳性反应弱.琼脂包埋组织经过常规脱水,蜡
21、块经过切片,染色,可见细胞集中,密度高,细胞边界清楚,并见核仁;细胞排列呈片状,团巢状,乳头状,腺腔样,并见癌珠样结构.部分细胞浆内见黏液空泡.运用免疫组化抗体标记,阳性反应强,定位清楚.涂片组与切片组细胞数比较见表 1.表 I20 例胸腹腔积液切片与涂片细胞数比较3 讨论脱落细胞涂片中炎性增生或退变的间皮细胞与某些恶性细胞尤其是腺癌细胞在形态上易于混淆,给诊断带来困难,采用脱落细胞的石蜡包埋切片,细胞经过梯度酒精的脱水和二甲苯处理后细胞膜的类脂质得到了充分的溶解,同时细胞被切片有利于染料和免疫组化抗体的进入和渗透,使细胞的形态结构比涂片更清晰,并使肿瘤细胞集中,提高细胞的阳性检测率.需要时可
22、反复切片,作免疫组化和特殊染色,以进步明确诊断,且免疫组化定位更准确.而用细胞涂片做免疫组化时,由于胸腹腔积液带有红细胞和含有血浆,常会出现一些背景染色,并且重复性差,造成抗体浪费.我们的试验中采用琼脂包埋和直接涂片法,两者细胞数前者多于后者,有一定差异,但统计学上无明显差异.分析原因,可能本文 20 例均为明显阳性病例.肿瘤细胞数多,两组从细胞数上未体现琼脂包埋的优越性.在常规检查中运用琼脂包埋,我们认为其操作简单,具有可行性,尤其是在送检的胸腹腔积液较少,离心后细胞沉淀物过少的情况下,可用加样器吸取,再用琼脂做支撑物包埋,不易使细胞分散遗漏.而用纱布或滤纸收集的沉淀物由于组织分散,不易用镊钳包埋.同时,胸腹腔积液沉淀物少者,诊断困难需作免疫组化染色时,采用琼脂包埋有较好的效果,既能集中细胞,避免浪费抗体,又能反复切片,运用多种抗体进行标记,利于鉴别诊断.在运用琼脂包埋时我们发现少数切片的细胞变形,胞浆变空,通过总结我们认为应注意:(1) 琼脂糖需要冷却且在没有凝固之前将细胞注入,温度过高细胞会受热变形,影响细胞的形态.琼脂过冷,接近凝固状态时则细胞难以注入.(2)离心会对细胞形态有些影响,因此离心机的速度不宜过快.4 参考文献I 段立疆,金锦善.简易胸水细胞石蜡制片
