1、1目录【摘要】 2【关键字】 21前言： 211 背景 .2111 金黄色葡萄球菌蛋白 A(Staphylococcal protein A，SPA) .2112 大肠杆菌 4113 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳） .4114 western blotting（ Western 免疫印迹） 412 目的 .513 原理 .5131 SPA 的原核表达 5132 蛋白的提取 6133 SDS-PAGE 7134 western blotting（ Western 免疫印迹） 82材料与方法： 921 材料： .922 方法： .9221 SPA 的原核表达 9222 蛋
2、白质的提取 11223 SDS-PAGE 11224 western blotting .14小结与心得体会 16参考文献 162【摘要】构建携带 Staphylococcal protein A(SPA) 基因的原核表达载体，诱导表达具有活性的 SPA。然后再通过 western blotting，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。【关键字】SPA，大肠杆菌，SDS-PAGE ，western blotting1前言：11 背景111 金黄色葡萄球菌蛋白 A(Staphylococcal protein A，SPA)金黄色葡萄球菌细胞壁的成分占整个细胞壁蛋
3、白的 6.7，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。SPA 能与人及多种哺乳动物血清 IgG 中的 Fc 片段结合，但亲和性各不相同。此外，其还能与血清中少量的 IgM 和 IgA 结合 1。因此已广泛的应用于 IG 亚类的检测和分离纯化，酶的固定化及各类生物分子的检测等。SPA 还能部分去除肿瘤患者和带瘤动物血清中的封闭抗体，从而降低血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。由于 SPA 的一些特殊的免疫学特性，引起广大免疫学者的关注，并逐渐发展成为免疫学上一种极为有用的工具。近年来，有关 SPA 分泌型融合体系的构建已日趋完善，并已广泛用来在细胞中表达、纯化异源基因的产物 233。SPA 的生物学特
4、性 41免疫原性与过敏原性 SPA 做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成 Ig，又能与其相应抗体的 Fab 段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPAIgG 注射家兔皮下可引起 Arthus 样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。 SPA 体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。2抗吞噬作用 由于 IgG 的 Fc 段结合点既是 lgG 调理活性结合点，又是SPA 反应点。因此，SPA 可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是 SPA 阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。3固定补体 SPAIgG 和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、3猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途
5、径。4促有丝分裂因子 SPA 是一种 B 细胞激活剂，固相 SPA 作用明显，并不需要 T 细胞辅助,可容性 SPA 作用微弱，必须有 T 细胞参与。5去封闭作用 固相 SPA 能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。SPA 的应用 51SPA 菌的协同凝集作用用已知的标准血清，吸附到 SPA 菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA 菌体及粗制免疫血清即可。
6、所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。协同凝集只适用于检测抗原，未见应用于检测抗体的报道。2作为广谱第二抗体 用 SPA 代替抗体 IgG 的第二抗体，有如下优点：SPA 制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的 IgG 都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；SPA 的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为 103 L/克分子，结合后对 IgG 的活性无影响。无论在 0、37、44及 56几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育
7、中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；SPA 容易标上 125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的 Fc 受体结合。SPA 分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受 Fc 受体影响，所以有较高的抗 IgG 特异性； 用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA 菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；SPA 与 lgG 结合是可逆的，用 4mol/L 尿素、4mol/L 硫氰酸、盐酸(pH2.5)或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。43用于提取纯
8、化 IgG 利用 SPA 与 IgG 的结合特性提取 IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex 柱，DEAE 柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。4检测和提纯 IgM IgM 在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性 IgM 抗体，必须首先在血清中除去 IgG。采用 SPA 菌吸附 IgG 是目前快速而又理想的办法，利用此法也为 IgM 的提纯开辟了道路。5其它方面 用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测等。112 大肠杆菌大肠杆菌，Escherichia coli (T. Escherich 1885)属于细菌界、变形菌门(Bacter
9、ia)、- 变形菌纲(Proteobacteria)、肠杆菌目 (Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌种(E. coli)。113 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳）目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的
10、电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18m），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影 响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此 可见，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 65114 western blotting（Western 免疫印
11、迹） 7免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。 Western Blotting的protocol种类繁多，但大同小异，基本为上述几个步骤。要得到一个完美的实验结果，不仅需要优质的抗体，同时应对整个实验流程和体系进行严
12、格的质量控制，才能最终达到你的实验目的。影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。12 目的1掌握 LB 培养基的配制方法；2掌握无菌接种的操作方法；3掌握蛋白诱导表达的原理；4His-Tag 表达蛋白纯化原理、方法；5掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；6垂直板状凝胶电泳槽的使用和凝胶配制方法；7学会利用相对迁移率和
13、蛋白质色带形状分析蛋白质的种类；8掌握 western blotting 的原理和方法。613 原理131 SPA 的原核表达大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者 Tag 检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。E. coli 的乳糖操纵子包括 4 类基因：结构基因，能通过转录、翻译使细胞产生一定的酶系统和结构蛋白，这是与生物性状的发育和表型直接相关的基因。乳糖操纵子包含 3 个结构基因：lacZ、
14、lacY、lacA。LacZ 合成 半乳糖苷酶，lacY 合成透过酶，lacA 合成乙酰基转移酶。操纵基因，控制结构基因的转录速度，位于结构基因的附近，本身不能转录成 mRNA。启动基因 P，位于操纵基因的附近，它的作用是发出信号，mRNA 合成开始，该基因也不能转录成 mRNA。调节基因 i：可调节操纵基因的活动，调节基因能转录出 mRNA，并合成一种蛋白，称阻遏蛋白。操纵基因、启动基因和结构基因共同组成一个单位操纵子（operon） 。 调节乳糖催化酶产生的操纵子就称为乳糖操纵子。其调控机制简述如下：抑制作用：调节基因转录出 mRNA，合成阻遏蛋白，因缺少乳糖，阻遏蛋白因其构象能够识别操纵
15、基因并结合到操纵基因上，因此 RNA 聚合酶就不能与启动基因结合，结构基因也被抑制，结果结构基因不能转录出 mRNA，不能翻译酶蛋白。诱导作用：乳糖的存在情况下，乳糖代谢产生别乳糖（alloLactose），别乳糖能和调节基因产生的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白改变构象，不能在和操纵基因结合，失去阻遏作用，结果 RNA 聚合酶便与启动基因结合，并使结构基因活化，转录出 mRNA，翻译出酶蛋白。负反馈：细胞质中有了 半乳糖苷酶后，便催化分解乳糖为半乳糖和葡7萄糖。乳糖被分解后，又造成了阻遏蛋白与操纵基因结合，使结构基因关闭。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，
16、因此被实验室广泛应用。132 蛋白的提取His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是 Porath et al.1975 年用固定 IDA 作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987 年 Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的 IDA-sephadex
17、 G-25 作用力更强，此前在 1986 年他和他的合作者用 Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年 1987 年 Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和 Ni2+-NTA 填料作用力更强于普通的肽，1988 年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986
18、年 Porath et al.还发现 Fe3+-IDA-sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现 Ga3+-IDA 也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时 IMAC 也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。133 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称 Acr) 和交联剂 N，N亚甲基双丙烯酰胺（简称 Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区8带，如
19、果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称 SDSPAGE）。由于 SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具
20、三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDSPAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDSPAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。（1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）颗粒小、呈球形的样品分子移动快，颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞时的阻力大，移动慢。（2）不连续系统对样品的浓缩效应凝胶层的不连续：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时的阻力小，移动快，而在小孔径中，移动慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝
21、胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。（3）电荷效应当进入 pH8.9 的分离胶后，各种血清蛋白质所带静电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷越多，则迁移快；反之则慢。因此各种蛋白质按电荷少，分子量大小及分子形状以一定的顺序排列形成一个个区带。不连续聚丙烯酰胺凝胶系统所具备的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。9134 western blotting（Western 免疫印迹）将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。与 Southern 或 Northern杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“
22、显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。2材料与方法：21 材料：器材：离心机，摇床，垂直板电泳槽，转移电泳槽，硝酸纤维属膜，NC 膜，电泳仪，移液枪，枪头，三角瓶，离心管（50ml） ，移液管，微量移液管，烧杯，试管，玻璃棒试剂：大肠杆菌，LB 培养基(蛋白胨
23、、酵母提取物、氯化钠 )，5* M9 盐溶液（Na 2HPO412H2O、KH 2PO4、NaCl、NH 4Cl） ， M9 培养基（5* M9 盐溶液、1mol/l MgSO4、1mol/lCaCl 2，20% 葡萄糖） ，IPTG.。Tris，甘油，SDS，溴酚蓝，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，2巯基乙醇，过硫酸氨，TEMED ，甘氨酸，盐酸，考马斯亮蓝 R-250，甲醇，冰醋酸，标准蛋白marker。丙烯酰胺，N，N ， 亚甲丙烯酰胺，Tris，SDS，Glycerin，TEMED ，过硫酸氨，考马斯亮蓝，氯化钠，氯化镁，甲醇，2巯基乙醇，溴酚蓝，甘氨酸，BSA，吐温，羊抗兔 IgG-HRP 等
24、。1022 方法：221 SPA 的原核表达2211 试剂配方表一胰蛋白胨 1g酵母提取液 0.5gNaCl 1g琼脂 0.5g蒸馏水 100mlLB -Amp+固体培养基调 pH 约 7.00.1g/ml Amp+ 50lNa2HPO412H2O 8.55gKH2PO4 1.5gNaCl 0.25g(NH4)Cl 0.5g5*M9 盐溶液蒸馏水 100ml5*M9 盐溶液 20ml1mol/LMgSO4 200l1mol/L CaCl2 10l20%葡萄糖 2ml蒸馏水 78mlM9 -Amp+培养基0.2g/ml Amp+ 50l2212 无菌接种（划平板）配置 LB-Amp+固体培养基在
25、无配置菌操作台上，待培养基凝固后用接种环蘸取菌液，将菌种划线接种于 LB-Amp+固体培养基表面。平板放 37培养箱中倒置培养过夜。2213 挑单菌落、小摇配置 20ml LB-Amp+液体培养基，分装到 3 支试管中。用中号枪头蘸取菌11落放入液体培养基中，37 ，150rpm，振荡培养过夜。2214 扩大培养配置 M9 -Amp+培养基 100ml，将 5ml 菌液接种入含 100ml M9- Amp+培养基的锥形瓶中扩大培养，37 ，150rpm 振荡培养 4-5 小时，至细菌达到对数生长期（先摇菌 2 小时，以后每隔 15min 检测 OD600 数值，OD 值达到 0.35 左右时，
26、是细胞生长最快的时候，一直到 0.6 期间为对数生长期 ） 。取样品 A11mL置于 EP 管中， 4，12000 r/min 离心 10 min 收集细菌沉淀，弃去上清；置于-20中贮存备用。2215 诱导培养将扩大培养的菌种迅速进行低温（冰水浴）冷却 5 分钟，于 15，150rpm振荡培养 45 分钟后。加 IPTG（终浓度为 0.80mmol / L）100l 诱导，继续于15，150rpm 振荡培养 4 天。取诱导后的样品 A21mL 置于 EP 管中，4，12000 r/min 离心 5 min 收集细菌沉淀，弃去上清；置于 -20中贮存备用。222 蛋白质的提取2221 配置 P
27、BS 缓冲液NaH2PO42H2O 0.2964gNa2HPO412H2O 2.901gPBS 缓冲液NaCl 8.5g2222 离心收取菌液用 50ml 离心管分别取约 30ml 菌液，用 PBS 缓冲液调平衡，置于8000r/min，4离心机中离心 20min，直接倒掉上清液；大约用 30mlPBS 缓冲液分批将两个离心管中的沉淀转移到一个管中，跟其他一组调平衡后再离心25min，去上清液；最后加约 20ml PBS 重悬，形成悬浊液。2223 破碎细胞将重悬液置于冰水浴中放入超声波细胞粉碎机隔音箱中，调节间隔时间125s，工作时间 2s，工作次数 90 次，按下工作复位开始工作。2224
28、 获得细胞内容物将破细胞后的 EP 管置于 10000/min 离心机中离心 20min，留上清液，只4贮存备用。223 SDS-PAGE2231 试剂配方（1）2M Tris-Hcl（pH8.8） ，100mlA称取 Tris 碱 24.2gB 加入 20ml 水溶解C用浓盐酸调 pH 到 8.8（约 4ml）D定容至 100ml（2）1M Tris-HCl（pH6.8） ，100mlA称取 Tris 碱 12.1gB加入 50ml 水溶解C 用浓盐酸调 pH 到 6.8（约 8ml）D 定容至 100ml（3）10% （W/V）SDS，100mlASDS 10gB定容至 100ml（4）5
29、0% 甘油 100mlA倒取 100%甘油 50mlB加水至 100ml（5）1% （W/V）溴酚蓝 10mlA溴酚蓝 100mgB用 10ml 水溶解，过滤除去聚合的染（6）A 液：丙烯酰胺储存液 100（30% （W/V）丙烯酰胺，0.8%（ W/V）双丙烯酰胺） A丙烯酰胺 29.2gB双丙烯酰胺 0.8gC蒸馏水 定容至 100ml石蜡膜封口，可在 44存放数月（7）B 液：4 分离胶缓冲液 100mlA2M Tris-HCl（pH8.8） 75mlB10% SDS 4mlC蒸馏水 定容至 100ml 可在 4存放数月（8）C 液：4 堆积胶缓冲液 100mlA1M Tris-HCl（
30、pH6.8） 50mlB10% SDS 4mlC蒸馏水 定容至 100ml 可在 4存放数月（9）10% 过硫酸铵（APS ） 5mlA过硫酸铵 0.5gB蒸馏水 定容至 5mlC1.5mlEP 管分装，铝箔避光，-20冻存（10）电泳缓冲液（pH8.3） 1LATris 碱 3gB甘氨酸 14.4gCSDS 1g13D蒸馏水 定容至 10ml（11）5 样品缓冲液 10mlA1M Tris-Hcl（pH6.8） 0.6mlB50%甘油 5mlC10%SDS 2mlD2-巯基乙醇 0.5mlE1%溴酚蓝 1mlF蒸馏水 0.9ml 分装 1.5mlEP 管， 4保存数周， -20保存数月（12
31、）12% 分离胶（pH8.8） 10mlAA 液 4 mlBB 液 2.5 mlC蒸馏水 3.5 mlD10%Ap 50lETEMED 5l注意：迅速混匀，不能产生气泡。（13）5% 堆积胶（pH6.8） 5mlAA 液 0.67 mlBC 液 1mlC蒸馏水 2.3 mlD10%Ap 30lETEMED 5l注意：迅速混匀，不能产生气泡。（14）考马斯亮蓝染液 1LA考马斯亮蓝 R-250 1.0gB甲醇 450ml C蒸馏水 450mlD冰醋酸 100ml （15）考马斯亮蓝凝胶脱色液 1LA甲醇 100mlB冰醋酸 100mlC蒸馏水 H2O 定容至 1L2232 灌制分离胶1装好灌胶用
32、的模具；2将 A 液，B 液及蒸馏水在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺（ A 液）是神经毒素，操作时要戴手套；3加入过硫酸铵和 TEMED 后，轻轻搅拌使其混匀；4小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内；5当加入适量分离胶溶液时，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层 1ml 的蒸馏水，这使凝胶表面变得平整，还可以补充凝胶中损失的水分；6等待 30min，是凝胶聚合。2233 灌制分离胶1吸尽覆盖在分离胶上的水；2将 A 液，C 液及蒸馏水在一个小烧杯中混合；143加入过硫酸铵和 TEMED 后，轻轻搅拌使其混匀；4将堆积胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端； 5将梳子插入凝胶内，直至
33、梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生；6约 30min 凝胶聚合；7凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂；8将凝胶放入电泳槽内，将缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。2234 样品制备和上样将 A1 、A 2 样品分别与 400l 蒸馏水和 100l 5样品缓冲液混合，放入100加热 8min，离心，留上清。再分别将 A1 20l、标准蛋白marker20l、 A220l 用微量移液管分别加入到 2、3、4 号加样孔，其它加样孔均加入 5l 上样缓冲液。注意：避免产生气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔
34、中。2235 电泳开始电压为 150V，当进入分离胶后改为 120V，当样品跑到溴酚蓝凝胶边缘约 5mm 时，停止电泳。2236 剥胶与染色电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色 30min2237 脱色染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次。再用脱色也脱色，直到蛋白区带清晰。224 western blotting2241 试剂配制1) 转移缓冲液：600ml 蒸馏水中加入3.03gTris，14.41gGly，200ml 甲醇，加蒸馏水至 1000ml。152) 封闭液：含 5脱脂奶粉，0.2Tween-20 的PBS 缓冲液。3)洗涤液：含 0.2Tween-
35、20 的 PBS 缓冲液 。4）抗体稀释液：含 5脱脂奶粉，0.2Tween-20 的PBS 缓冲液。5）显色剂：DAB（二甲基联苯胺）16mg，30H2O2 80l，加 0.01mol/L Tris-HCl（pH7.2）至总体积 20ml，新鲜配制。6）PBS 缓冲液（ pH7.4）：在 800ml 蒸馏水中溶解 NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO412H2O 3.632g、 KH2PO4 0.24g，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至1L，151bf/in2 （ 1.034105Pa）高压蒸汽灭菌 20 分钟，保存于室温2242 转膜1) NC 膜处理：用刀切与凝胶
36、大小相等的 NC 膜，浸于转移缓冲液中30min；2) 凝胶处理：去离子水略漂洗，浸于转移缓冲液中 30min；3) 海绵、滤纸处理：剪切与 NC 膜大小相等的滤纸 6 块，海绵、滤纸浸于转移缓冲液中；4) 夹心饼制作：（负极）黑塑料板海绵3 层滤纸凝胶NC 膜3 层滤纸海绵白塑料板（正极）每一层用玻璃棒在其表面上轻轻滚动以除去气泡合拢转移夹板，并将夹板两侧锁住5) 电泳：4 ，2mA/cm 恒流，转移电泳 12h，然后卸装置，取 NC 膜，切左下角做标记；6) 染色：印迹后的 NC 膜用 20ml PBS 漂洗 10min；用封闭液（含 5牛奶、0.5Tween-20 的 PBS）37 封闭
37、 3h，倒出，弃封闭液，用 PBST 漂洗 3 次，每次 10min；与一抗反应：37振荡 2h，抗体稀释比例为 1：400（用后回收） ，用PBST 漂洗 3 次，每次 10min；16与酶标二抗反应：37振荡 2h，抗体稀释比例为 1：400（用后回收） ，用 PBST 漂洗 3 次，每次 10min；转入 10ml 显色剂中浸泡 23s，即可见棕色谱带，一旦谱带显示，立即取出用大量水冲洗，终止反应；拍照3结果与讨论：图中 1 为 A2 的电泳带，2 为标准蛋白 maker 的电泳带，3 为转膜后的 NC 膜上的电泳带，4 为转膜后的凝胶膜上的电泳带（凝胶上没有条带，说明转膜比较成功） ；
38、图中左侧 KD 值为标准蛋白中条带所对应的 KD 值。SPA 即为图中所示，说明待测样品中确实有 SPA，证明诱导是成功的。小结与心得体会在这次 SPA 的表达、制备及鉴定实验中，主要是按照指导书上的步骤来，每一步都要非常谨慎。从最开始的 SPA 的原核表达，挑单菌落，要注意无菌操作；扩大培养时，要随时监测菌的生长情况，在对数生长期是进行诱导培养。然后是蛋白质的提取。接着就是 SDS-PAGE，在这个小实验过程中首先要注意的是电泳槽的胶条和玻璃板要保证干净干燥；其次，分离胶和堆积胶的灌制也要注意动作迅速，以免出现胶不是同时凝固而引起的胶不均匀情况；最后就是在电泳时要注意正负极别接反。前面的 S
39、DS-PAGE 为 western blotting 的实验打下基础，做起来就相对轻松了不少。这次实验，从最终条带上来看，实验结果还可以。通过这次的生物技术综17合性实验，让我深刻的体会到实验不仅需要认真的态度，还需要严密的思维。实验操作能力固然重要，但相应的理论知识也是不可或缺的。在实验过程中学到了很多，不论理论知识水平，还是实验操作能力都有所提高。在此感谢各位老师的耐心指导，这次的学习将会是我学习生涯中不可或缺的一部分。参考文献1 Shpigel E，Goldlust A，et al ，Expression ，purification and applications of staphyl
40、ococcal Protein A fused to cellulose-binding domainJBiotechnol Appl Biochem，2000，31：1972032 李平，邱平金黄色葡萄球菌蛋白 A 分泌型融合表达系统J 生物工程进展，1994，14（1）：31343 Vollenkle C ，Weigert S，Ilk N ，et alConstruction of a functional Slayer fusion proteincomprising an immunoglobulin G-binding domain for development of specific adsorbents for extracorporeal blood purificationJAppl Environ Microbiol ，2004，70（3）：151415214 http:/ 生物实验网5 http:/ 生物实验网6 http:/ 生物无忧7 http:/ 生物无忧论坛
