1、口臭研究模型的建立及其对口腔致臭菌的确定?226?华西口腔医学杂志第 25 卷第 3 期 2007 年 6 月WestChinaJournalofStomatologyVo1.25No.3Jun.2007【文章编号】1000-1182(2007)03-0226-04口臭研究模型的建立及其对口腔致臭菌的确定胡赞,胡德渝,郑雷蕾,林居红(1.重庆医科大学附属口腔医院预防科,重庆 400015;2.四川大学华西口腔医院预防科;3.正畸科,四川成都 610041)【摘要】目的建立一个可模拟口臭代谢过程的唾液沉淀物系统,同时分析几种细菌对口臭产生的影响,为致臭菌的确定提供依据.方法收集 1O 名牙周健康
2、个体的刺激性全唾液 1O 份.调整离心全唾液的上清液和沉淀物的比例,建立口臭研究模型,在 37兼性厌氧条件下孵育使其产生臭味,7h 内每隔 1h分别用鼻闻法检测气相和液相的臭味指数,用 Halimeter量挥发性硫化合物(VSCs)水平,用玻璃电极IrpH 值.在经过 1h 孵育后的口臭模型内,分别加入可疑致臭菌(牙龈卟啉单胞菌,具核梭杆菌,中间普氏菌)菌悬液以及作为对照的非致臭菌(伴放线放线杆菌)菌悬液和蒸馏水,继续在 37兼性厌氧条件下孵育,在余下的 6h 内每隔1h 测量 1 次各组的臭味指数,VSCs 水平及 pH 值.结果调整离心全唾液比例后的口臭模型能模拟口臭代谢过程,产生明显的臭
3、味.在孵育 1h后的口臭模型内,加入可疑致臭菌菌悬液后,臭味产生相对于伴放线放线杆菌组和蒸馏水组高,牙龈卟啉单胞菌组相对显着.结论孵育离心全唾液为研究口臭产生的有用模型.通过改变致臭细菌的数目来改变微生物负载,对细菌代谢的活性会产生影响,从而影响臭味的形成,可以此来确定致臭菌.【关键词】口臭:挥发性硫化合物;口臭模型【中图分类号】R780.2【文献标识码】AEstablishmentofMalodorModelandItsEffectsonIdentifyingtheHalitosis-relatedBacteriaHUYun,HUZHENGLei-te3,LINJu 一.jl0,l.(1.D
4、ept.ofPreventiveDentistry,AffiliatedHospitalofStomatology,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400015,China;2.Dept.ofPreventiveDentistry,WestChinaofStomatology,SichuanUniversity,Chengdu610041,China:3.Dept.ofOrthodontics,WestChinacbStomatology,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)【AbstractO
5、bjectiveToestablishasalivarysedimentmalodorsystem,andtoevaluatetheeffectofseveralkindsofbacteriadedicatedtothehalitosisformation,hencetoidentifyhalitosiscorrelatedbacteria.MethodsTheproportionofthesupernatantandsediment,gainedfromcentrifugalwholesaliva,wasadjustedtoestablishasalivarysedimentmalodors
6、ystemincubatedinfacultativeaerobicenvironmentunder37for7hours.Thehalitosisindexesinbothgaseousphaseandliquidphasewerecheckedbydirectsniffing,andvolatilesulphurcompounds(VSCs)andpHweredeterminedbyhalimeterandglasselectroderespectivelybetweenhourstoevaluethemalodorformation.Thesuspendedfluidofsuspicio
7、ushalitosis.correlatedbacteriaandnon.halitosis.correlatedbacteriaandwatercontrolwereintroducedintothesalivarysedimentsystemincubatedfor1hour.Thefivegroupswereincubatedinfacuhativeaerobicenvironmentunder37oCintheresidualhours.Thehalitosisindexes.VSCsandpHchangeswererecordedbetweenhours.ResultsThesali
8、varysedimentmalodorsystemcallsimulatethemetabolismofhalitosisformationtoproducehalitosis.Theodorsofthesuspicioushalitosis-correlatedbacteriaintroducedgroupswerehigherthanthenonhalitosiscorrelatedbacteriaand?watercontrolgroup.ConclusionWithitssimplebutfundamentalmanipulations,incubatedwholesalivaisap
9、owerfulmodelforstudyofthemetabolismoftheoralmixedmicrobialflora,matodorformation,andotheroraldiseases-relatedprocesses.Keywords】halitosis.volatilesulphurcompounds:salivarysedimentmalodorsystem口腔中微生物的腐化来源于寄生在舌和龈沟中的细菌,这是产生口腔异味的重要原因.ke 等1】通【收稿日期】2006-0“/-05; 【修回日期】2006-10-26【作者简介】胡赞(1979-),男,四川人,住院医师,硕
10、士【通讯作者】胡德渝,Tel:1398034990过气相色谱分析等技术检测口臭气体的组成,发现这种气味由挥发性硫化合物(volatilesulphurCOIIIpounds,VSCs),吲哚,甲基吲哚,胺和脂肪酸组成,它们来源于微生物发酵唾液,血液,鼻腔中的黏液素,龈沟液,溶解的中性白细胞和上皮细胞碎华西口腔医学杂志第 25 卷第 3 期 2007,年 6 月westchiIlaJoumBlofStomatooVo.25N0.3Jun.2007:屑中的蛋白多肽.其中,VSCs 是导致口臭的重要成分,主要由厌氧菌分解食物中的含硫氨基酸产生,包括硫化氢(H2S),甲基硫醇(CHSH)和乙基硫化物(
11、cn3sCH 等.细菌腐化是产生口臭的主要代谢过程.本研究通过对全唾液标本进行离心,建立一个唾液沉淀物系统的模型,并利用该模型来模拟口腔内口臭的产生.1 材料和方法1.1 实验菌株和实验器械牙龈卟啉单胞菌,中间普氏菌,具核梭杆菌,伴放线放线杆菌由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供.RC 一 28S 离心机(Dupont 公司 ,美国),玻璃电极,离心管,密封小试管,微量加样器(海门舒康公司),MM 一 1 微型振荡器(江苏金城公司),Halimeter 口气测量仪 (Interscan 公司,美国),数字 pHil量仪(Orion 公司,美国),三气培养箱(上海金钟公司).1.2 实
12、验对象选取四川大学华西口腔医学院 10 名学生为实验对象,其中男性 5 名,女性 5 名,年龄 2227 岁.纳入标准为:无全身系统疾病,3-月内未服用抗生素,半年内无牙周治疗史,牙周探诊深度在 3mm 以下,无探诊出血,无牙周附着丧失,鼻闻法臭味指数为零,Halimeter 仪器检$VSCs 的体积分数小于2xl0-7.1.3 标本的采集要求 10 名学生禁食 12h,并且 24h 没有进行口腔清洁措施,在早上同一时间通过咀嚼石蜡收集每名学生的刺激性全唾液 1 份,每份 10mL,共 10 份.将所收集的全唾液置于无菌离心管离心后,吸出部分上清液,使上清液和沉淀物的比例为 2:1.振荡均匀后
13、将每份分成 6 组孵育混合物,每组 750L,由唾液沉淀物 16.7%,唾液上清液 33.3%和为菌悬液预留的 50.0%空间组成,置于密封小试管内,低温一20保存,备用.1.4 口臭研究模型的建立从每名实验对象的 6 组孵育混合物中选用 1 组孵育混合物,共 10 组,在 37兼性厌氧条件下孵育使其产生臭味,7h 内每隔 1h 分别用鼻闻法检测气相(直接鼻闻) 和液相 (用玻璃棒蘸取后鼻闻) 的臭味指数,用不连续的分级记录臭味程度,臭味的程度分为 04 度,其中 0 为无气味;1 为很难闻到气味;2 为轻微不愉快气味;3 为中度不愉快气味;4 为强烈刺鼻的气味.用 Halimeter 仪器测
14、量 VSCs 水平,用玻璃电极和数字 pH$i 仪测量 pH 值.1.5 细菌对臭味产生影响的测定将实验对象离心全唾液剩下的 5 组孵育混合物经 1h 孵育后,分别加入可疑致臭菌(牙龈卟啉单胞茵,中间普氏菌,具核梭杆菌)菌悬液 50.O%(浓度为每毫升 lxl06CFU)以及作为对照的非致臭菌(伴放线放线杆菌)菌悬液 50.0%(浓度为每毫升 lxl0cFu)和蒸馏水 50.0%,分别为牙龈卟啉单胞菌组,中间普氏茵组,具核梭杆菌组,伴放线放线杆菌组和蒸馏水组.然后继续在 37兼性厌氧条件下孵育,在余下的 6h 内每隔 1h 分别用鼻闻法检测气相和液相的臭味指数,用 Halimeter4 量 V
15、SCs 水平,用数字 pH测量仪测量 pH 值.1.6 统计学分析所得的数据用 Excel 录入计算机 ,采用 SPSS11.0 统计软件进行统计处理与分析.2 结果2.1 口臭研究模型的测量结果鼻闻法测量结果显示测得的 10 组孵育物每小时臭味指数比较接近,随时间呈上升趋势.液相臭味指数在 2h 时开始上升,在 35h 的平台期后,在 6h时上升至 2,其后保持稳定.气相臭味指数在 5h 时与液相口臭指数相等,而其余时间均低于液相口臭指数,它从 4h 时开始上升至 1 后便保持稳定(图 1).?.气相a 一液相12j4567时间(-I)图 11:3 臭研究模型中气相和液相臭味指数变化Fig1
16、Changesingaseous-phaseodorandliquidphaseodorinthesalivarysedimentmalodorsystem口臭研究模型中 VSCs 的体积分数见图 2.孵育混合物中来自离心全唾液沉淀物的细菌可以利用全唾液上清液中的底物,发生腐化,生成 VSCs,从而使臭味产生,随着时间的变化,VSCs 生成的量逐渐增加.用玻璃电极和 pH 测量仪测得的每小时孵育物pH 值基本无变化,接近于 7.2.2 口臭模型中加入细菌后的测量结果加入细菌后各组气相和液相口臭指数的增加值见表 1.每组液相口臭指数增加值均高于气相口臭指数增加值,加入不同细菌菌悬液的口臭模型检测
17、5432lO籁华西口腔医学杂志第 25 卷第 3 期 2007 年 6 月?228?WestChinaJournatofStomatologyVo1.25No.3Jun.2007到的臭味指数增加不同,经单因素方差分析,4 组间臭味指数增加值的差别有统计学意义0.05).其中.加入牙龈卟啉单胞菌组的气相和液相口臭指数增加值最大,而加入伴放线放线杆菌组增加值最小.加入不同细菌菌悬液各组与蒸馏水组比较,经 q 检验显示,除伴放线放线杆菌组外,其余 3 组均表现有统计学意义(P0.05).暑籁蛙(32oo150loo5OO1234567时间 Oh)图 2 口臭研究模型中 VSCs 的体积分数Fig2T
18、hevolumefractionofVSCsinthesalivarysedimentmalodorsystem表 1 加入细菌后各组气相和液相口臭指数的增加值01=10,i 土 s)Tab1Changesofgaseous-phaseodorindexandliquid-phaseodorindexinthesalivarysedimentmalodorsystemofthefivetestgroups(n=10.土 F)口臭指数增加值气相液相加入不同细菌菌悬液的口臭模型中 VSCs 的增加值也有所不同,牙龈卟啉单胞菌组,具核梭杆菌组,中间普氏菌组,伴放线放线杆菌组和蒸馏水组中 VSCs 增
19、加值分别为(5.94800.8828)xl0,(3.80000.4630)xl0-7(3.95100.5698)xl0-7(1.2350o.1929)xl0,(1.23900.1925)xl0.其中加入牙龈卟啉单胞菌组增加最多,与其余各组相比存在统计学差异 0.05).各组 VSCs 的增加值与蒸馏水组比较,除伴放线放线杆菌组外,其余均显示有统计学差异(P0.05).3 讨论3.1 口臭的产生在绝大多数情况下,口臭来源于口腔内的微生物(主要是革兰阴性厌氧菌)对含硫氨基酸腐化分解的结果,口腔气体中的 VSCs 和口臭的形成有密切关系圆.VSCs 的口腔来源主要是龈沟( 牙周袋)及舌背 .以往认为
20、口臭常伴有牙周病,并且随着牙周袋的加深而增加,牙周病患者口气中的 VSCs 明显高于牙周健康者,牙周袋是产生 VSCs 的重要部位.但是有研究发现,口臭,VSCs 水平和牙周病没有明显相关性,很多有口臭的人,牙周是健康的,舌是产生口臭的主要部位【3】.口臭及 VSCs 水平可以通过刷牙,刷舌背,咀嚼运动以及用抗菌药物含漱而降低,主要是通过减少细菌的量来减少 VSCs 的产生,细菌的量是口臭形成的重要原因.3.2 口臭研究模型的建立全唾液经离心分成沉淀物和上清液,对这 2 部分的检查可判断它们各自在臭味形成过程中所起的作用.当二者单独孵育时,沉淀物可产生一些臭味,而上清液几乎不产生.但二者混合一
21、起孵育时,就可产生明显的臭味.表明沉淀物提供了产生臭味所必须的细菌以及使臭味能够产生的少量底物网.上清液里含有使沉淀物中的细菌产生臭气所需要的绝大部分底物.这些有气味的产物是口臭的主要成分.全唾液在口臭产生中必须的主要成分之一是其中的混合细菌,这些细菌绝大部分是口腔内的常驻菌,其中许多附着于上皮鳞屑,很容易并不断地从口腔软组织表面脱落.第 2 种主要成分是从各唾液腺分泌的唾液,加上脱落的细菌和上皮细胞.根据牙龈炎症的程度,全唾液中也可能有来自龈沟和牙周袋内的液体存在.本研究在体温下孵育全唾液,发现在不同时间段所产生的臭味和从人口腔中挥发出来的臭味相类似.由于在刺激性全唾液的收集过程中,只有较少
22、量的细菌从口腔表面脱落,分离出来.离心后的唾液沉淀物约占全唾液的 0.5%2.0%,而更合适的模拟则需要约 10%或更多的量.因此,本研究将全唾液离心后加入减量的唾液上清液重组成沉淀物,这样使得细菌的浓度达到合适的水平.同时,为了保证重复性,做到以下 2 点:1)全唾的收集在早上同一时间,禁食至少 12h,24h 内没有进行口腔清洁;2)控制细菌浓度,因为它对细菌的生物反应速度有较大的影响.实验将离心后的唾液沉淀物的量调整到 16.7%,该浓度在葡萄糖浓度对菌斑糖酵解的作用的体内和体外实验同中得到验证,可提供与体内菌斑糖酵解类似的细菌浓度.本研究中对口臭研究模型的测量结果显示,模型在 37兼性
23、厌氧孵育下,7h 内口臭值有明显改变,呈上升趋势,证明了其内有足够的细菌和底物即含硫氨基酸,细菌能利用,分解该底物,从而产生臭味.研究结果验证了模型产生口臭的效果,可作为一个研究口臭产生的模型.而且,由于该模型华西口腔医学杂志第 25 卷第 3 期 2007 年 6 月WestchimJournalofStomatolagyVo1.25No.3Jun.2007:丝一:可在体外模拟口臭在体内的代谢过程,操作也简便易行,出于保护人体和节省费用的考虑,模型对于新的抑制口臭的除臭剂等药物,在临床实验和昂贵的临床研究开始之前的实验也有不错的应用前景.3.3 口臭研究模型应用于致臭菌的确定厌氧性致病菌在致
24、口臭形成中起重要作用 ff.福赛斯拟杆菌,牙龈卟啉单胞菌,中间普氏菌,具核梭杆菌以及栖牙密螺旋体都属于革兰阴性厌氧菌,能够利用细菌底物生成 VSCs,为可疑致臭菌网,而伴放线放线杆菌却不能在体外产生 VSCs,为非致臭菌.由于福赛斯拟杆菌和栖牙密螺旋体在人工培养基和组织培养基上不易生长,因此本研究选用牙龈卟啉单胞菌,中间普氏菌,具核梭杆菌来进行实验.从最终的臭味指数和 VSCs 指数增加值可以看出,由于加入细菌造成的微生物负载的不同,各组的增加值不完全相同,牙龈卟啉单胞茵组增加最为明显,具核梭杆菌组和中间普氏菌组其次,显示牙龈卟啉单胞菌组有最强的致臭能力,牙龈卟啉单胞菌的加入造成了臭味的明显增加,这与其临床口臭
