1、肝纤维化逆转中 MAPKERK 信号转导通路的活化及其特征第 16 卷第 15 期2006 年 8 月中国现代医学杂志ChinaJournalofModemMedicineV01.16No.15Aug.2006文章编号:10058982(2006)15 225304肝纤维化逆转中 MAPK/ERK 信号转导通路的活化及其特征木潘勤 t,谢渭芬 2,张忠兵 z,张新 s,韩泽广(1.上海第二医科大学附属新华医院消化内科,上海 200092;2.第二军医大学附属长征医院消化内科,上海 200003;3.国家人类基因组南方研究中心 ,上海 201203)?论着?摘要:目的探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(
2、mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK)信号转导通路与肝纤维化自发逆转的相关性.方法采用 CC14 注射 SD 大鼠 8 周.随后停药 6 周建立肝纤维化自发逆转的动物模型 .采用 cDNA 微阵列杂交检测纤维化消退期间 MAPK/ERK 级联反应中有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinasekin3se,MAPKKK),MAPKK,MAPK 等上下游激酶的表达变化.并通过Northern
3、 杂交加以验证.结果肝纤维化自发逆转过程中,HnS,A-raf.MAPKK2,ERK1 及核糖体 s6 蛋白激酶(s6proteinkinase,RSK1)等 MAPK/ERK 信号转导通路中的关键激酶表达水平均显着提高,并呈现顺序激活的时序关系,ns 抑制物的转录则明显下调.结论 MAPK/ERK 信号通路在肝纤维化消退时明显活化,可能与纤维化的自发逆转密切相关.关键词:有丝分裂原活化蛋白激酶;细胞外信号调节激酶;信号通路; 肝纤维化;逆转中图分类号:R 一 332 文献标识码:AActivationandcharacteristicsofMAPK/ERKsignalpathwaydurin
4、gspontaneousresolutionofhepaticfibrosisPANQin,XIEWei-fen2,ZHANGZhong-bing2,ZHANGXin3,HANZe-guang3(J.DepartmentofGastroenterology,XinhuaHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200092,P.R.China;2.DepartmentofGastroenterology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,P.
5、R.China,“3.NationalHumanGenomeResearchCenter,Shanghai201203,P.R.China)Abstract:【Objective】ToinvestigatetherelationshipofMAPIGERKsignalpathwayandtheautorevemibilityofhepaticfibrosis.【Methods】AnimalmodelofhepaticfibrosisautoreversibifitywasestabhshedbyCC14exposurefor8weeksandthenwithdrawfor6weeks.TheM
6、APK/ERKcascade,thereafter,wasdetectedbycDNAmicmarrayhybridizationandverifiedbynorthernblotduringtheresolutionofhepaticfibrosis.【Results 】CriticalmembersofMAPK/ERKsignalpathwayincludingH-ras,A-raf,mitogen-activatedproteinkinasekinase2(MAPKK2),exacel-lularsignalregulatedproteinkinase1(ERK1),andS6prote
7、inkinase(RSK1)exhibitedgreatlyup-regulatedexpres-sionlevels,whichwereprovedtoreachthepeaksuccessively,throughoutthehepaticfibrosisrecovery.Contrastively,themRNAlevelofrasinhibitorwassignificantlydecreased.【Conclusion】TheactivationofMAPK/ERKsignalingmayplayanimportantroleinthehepaticfibrosisautorever
8、sibility.Keywords:mitogen-activatedproteinkinase;extracellularsignal-regulatedproteinkinase;signalpathway;hepadcfibrosis;reversibility收稿日期:2005-06-27基金项目:中国博士后科学基金资助项目(No:2004036325)?2253中国现代医学杂志第 16 卷肝纤维化是慢性肝病向肝硬化进展的主要中间环节.近年来发现,无论是消除致病因素或是应用有效的抗纤维化药物,都可能部分或完全逆转患者及模型动物中的肝纤维化【-Sl.然而,肝纤维化的逆转过程十分复杂,影响
9、因素众多,确切机制仍不甚明了.多项研究证实,有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK)信号转导通路在多种损伤修复过程中发挥重要作用6-.1. 为此,笔者采用 SD 大鼠建立肝纤维化自发逆转的动物模型,在此基础上对纤维化逆转过程中 MAPKKK,MAPKK,MAPK 等激酶的表达变化进行检测,以期了解 MAPK/ERK 信号转导通路与肝纤维化逆转的相关性.1 材料与方法1.1 实验材料及主要仪器雄性 SD 大鼠由中国科学院上海实验动
10、物中心提供,质量为 180220g(27 只);OligotexmRNAMidi 试剂盒由 Qiagen 公司提供 ;33PdATP 及 32PdCTP 由 LifeSciences 公司提供 ;AtlasRat1.2 基因芯片由 BD 公司提供;引物由 Bioasia 公司合成;杂交采用 Hybaid 公司提供的杂交炉 ;杂交信号扫描采用 MolecularDynamics 公司提供的 phosphorimager扫描仪.1.2 建立肝纤维化自发逆转模型将 SD 大鼠随机分为正常对照组(/=5) 及肝纤维化逆转模型组(/=22).肝纤维化逆转模型组大鼠皮下注射 4o%cch(o.6mL/lO
11、0g 体重,首剂加倍),正常对照组则以同样方法注射等量精制橄榄油,每 3 天 1 次,共 8 周,此后停药 6 周.第 8,1O,12,14 周末分别处死 5 只肝纤维化逆转模型组大鼠,取肝组织进行纤维化程度的半定量评分:S1,汇管区及汇管区周围纤维化,局限性窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕,均不影响小叶的完整性;S2,虽有纤维间隔即桥接纤维化形成,但大部分小叶结构仍保留;S3,大量纤维间隔形成 ,分隔并破坏肝小叶,导致小叶结构紊乱,但尚无肝硬化;S4,早期肝硬化,可见肝实质广泛破坏,弥漫性纤维增生,被分隔的肝细胞团出现不同程度的再生及假小叶形成,但纤维间隔宽大疏松,改建尚不充分.1.3cDNA 微
12、阵列检测取正常对照组及第 8,1O,12,14 周肝纤维化逆转模型组大鼠的肝组织,以酚/氯仿法抽提 5 组总RNA,分别混合后分离 mRNA.通过 mRNA(1g),33PdATP(0.1mCi)37共孵育 1.5h 制备探针,探针经纯化,变性后与鲑精 DNA 封闭的 cDNA 微阵列于 68.C 杂交 1218h.随后顺序作低严谨度及高严谨度洗膜,磷屏曝光,扫描.图像经均一化后,采用 ArrayVision5.1 软件分析,以表达水平上调或下调 2 倍为条件筛选差异表达基因.1.4Northern 杂交按同样分组方法,取大鼠肝组织总 RNA(1O 组 )进行甲醛变性电泳,转膜,紫外交联.并以
13、逆转录一聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT_PCR)po获取 Araf,ERK1 及核糖体 S6 蛋白激酶 (S6proteinkinase,RSK1)的探针模板.引物序列为 Araf:5-TGGCGATGTAGCTGTGAAAG 一 3(上游),5-GTGAGCCCCTCA,IIGTAGGAA 一 3(下游),扩增片断长 336bp;ERK1:5一 CCCTCTAAAACCAAGGTGGCT 一 3(上游),5一 CATCCAATCACCCACACACAG 一 3(下游),扩增片断长 792bp;RSK1:5一 CAG
14、rI-rGTCCCACCAAGACCT-3(上游),5一 GTTCTGCTGAGGAGCCAGTC 一 3(下游),扩增片断长 591bp.探针经 32PdCTP(5Ci)标记后于 58杂交 2h,并进行洗膜,曝光.2 结果2.1 肝纤维化自发逆转模型的建立cch 皮下注射 8 周后,肝纤维化逆转模型组大鼠可见大量胶原沉积于小叶中央静脉,汇管区,肝窦间隙等部位,并形成纤维间隔.同时出现中央静脉扩大,肝细胞脂肪变性,炎性细胞浸润,肝星状细胞活化及增殖等肝纤维化的特征性改变.组织纤维化程度达 S3S4.停止毒剂注射后病理改变均逐渐减轻,胶原纤维显着减少,纤维间隔变少,变细.至第1O12 周时肝纤维
15、化逆转模型组的纤维化程度为S2S3,而第 14 周时仅为 S1.2.2 肝纤维化自发逆转时 MAPK/ERK 信号通路中的差异表达基因与阳性及阴性对照点进行比较后,cDNA 微阵列杂交发现 MAPK/ERK 级联反应中的关键激酶Araf,MEK2(MAPKorERKkinase2)及 ERK1在肝纤维化逆转时表达均出现上调,且显着高于正?2254?第 15 期潘勤,等:肝纤维化逆转中 MAPK/ERK 信号转导通路的活化及其特征常对照组,见附表.其中,第 l0 周时 Araf,MEK2mRNA 水平达到峰值,而第 l2 周的 ERK1 转录水平最高.此外,Hras 表达水平同样持续增高 ,但上
16、调幅度略低于 2 倍.纤维化消退过程中,对 MAPK/ERK 信号通路具有负调节作用的 Ras 抑制物则发生表达下调,呈水平进行性下降.附表肝纤维化逆转时 MAPK/ERK 信号通路中的差异表达基因一素,生长因子,细胞因子,缺血,应激等多种因素均可通过该通路调节转录因子的磷酸化,以及胞质蛋白激酶,磷脂酶,骨架蛋白等的转录和翻译,是细胞外信号引起细胞生理反应的共同途径11,1 习.根据活化的 MAPK 种类不同 ,哺乳动物细胞中的 MAPK 通路主要分为四条:MAPK/ERK 通路;应激活化蛋白激酶(stress activatedproteinkinase,SAPK),又称 JNKcJunNt
17、erminalkinase)通路;蛋白激酶 p38/PK 通路;MEK5 通路.其中的 MAPK/ERK 通路被公认为经典的 MAPK 信号转导通路.细胞外信号通过酪氨酸激酶受体(表皮生长因子受体,血小板衍生生长因子受体,胰岛素受体),TCR,CD28,BCR 及整合素聚集可激活 MAPK/ERK 通路及其下游激酶,并在小肠缺血再灌注,胃溃疡,肾脏及角膜损伤等的修复反应中具有重要意义一 31.但 MAPK/ERK 信号通路在肝纤维化逆转中的作用尚未明确.为此,笔者在既往动物模型及相关报道 fi4?151 的基础上,采用 CCld 橄榄油皮下注射诱导 SD 大鼠发生肝纤维,随之停止毒剂接触促使纤
18、维化自发恢复.结果证实,CC14 注射 8 周可见典型的肝纤维化病理改变,而停药后的第 l0,l2,l4 周末,病理表现与肝纤维化分期逐渐改善.在此期间 cDNA 微阵列及Northern 杂交表明,MAPK/ERK 信号通路中发挥MAPKKKK 作用的 Hras 表达始终处于较高水平,Araf(MAPKKK),MEK2(MAPKK),ERK1(MAPK)等上下游激酶的转录也显着上调,相应的抑制因子(ras 抑制物)mRNA 则大幅度减少 .提示该信号通路与肝纤维化的逆转密切相关.在 MAPK/ERK 信号通路中 ,Raf 通过 GTP 结合蛋白结合域,亮氨酸拉链二聚化序列,丝氨酸/苏氨酸激酶
19、的磷酸化位点等调节区域,与 Ras 及其它上游分子结合,并选择性激活不同的 MEK.活化的MEK 特异性识别“,nl 卜 Xrnlr“模序,继而激活通路中的核心激酶 ERK.ERK 活化后转入核内,进一步激活 NFKB,cMyc,c-Jun,cFos,Etsl,Elk1,Sap,Tal,CREB 和 Stat 等转录因子,抑制 Myb 和 PPAR,催化 ER,SRF,IL 一 6 和 EGFR 的磷酸化,从而诱导CyclinD1,SCF,E2F 等靶基因表达 ,促使细胞由 Go期进入到 Gl 期 t61;通过定位于微管组织中心,并磷酸化 MAP 一 1,MAP-2,MAP-4 和 Tau,E
20、RK 也参与细胞骨架的重分布 tt 刀;激活的 ERK 还可反馈调节 Ras的交换因子 Sos,CRaf-1,MEKI/2 和下游激酶p9ORSK.由此 MAPK/ERK 通路可调控发育,分化,?2255?中国现代医学杂志第 16 卷凋亡及细胞间功能同步化等重要功能旧,尤其是在细胞增殖过程中具有关键意义旧.肝纤维化逆转时 Araf,MEK2 表达明显增高,峰值出现于第 1O 周,分别为正常对照组的 2.89,3.85 倍.而第 12,14 周的 ERK1 转录水平最高,较正常对照组分别上升 2.98 及 2.36 倍.因而 MAPK/ERK 信号通路从肝纤维化自发逆转的早期即开始序贯活化,并持
21、续纤维化消退的全过程.同期肝细胞的增殖活动显着增强201.这表明该通路可能具有刺激肝细胞增殖,抑制其凋亡,并提高肝细胞分化程度等多重功能,从而多途径,多环节地参与肝纤维化逆转.RSK 是 MAPK/ERK 通路的重要底物,能协助ERK 转位人核,调控促增殖转录因子 cFos 的磷酸化;还可抑制 GSK3 的活性,减弱其对 c-Jun 的负调作用,进一步放大 ERK 信号 t211.此外,RSK 和 S6K 共同参与核糖体蛋白 s6 的活化,调节体内翻译过程.肝纤维化逆转的第 1O,12,14 周,RSK1mRNA 水平分别为正常时的 1.35,0.91,0.78 倍,显示 RSK1 主要在纤维
22、化逆转早期活化,并可能在一定程度上发挥与 ERK 的协同作用.然而,MAPK/ERK 信号通路不仅存在正反馈及负反馈调节,而且与 SAPK/JNK,p38,蛋白激酶 A(proteinkineA,PKA)等其它信号通路在多个水平上相互交联,构成复杂的信号网络.通路活化所需时间,激活维持时间,以及激酶活性高低对最终的生物学效应也会产生很大影响.因而对 MAPK/ERK信号通路在肝纤维化逆转中的作用与机制还需进行深人研究.参考文献:【11PETERAL,BONISMD,SCOTrL,etaLIsLiverFibrosisRe.-versibleJ.NEndJMed,2001,344(6):452-
23、454.【2】HAMMELPCOUVELARDA,OqOOLED,eta1.RegressionofliverfibrosisafterbiliarydH 血 ageinpatientswithchronicpancreafifisandstenosisofthecomlllonbileductJ.NEnslJMed,2001,344(6):418-423.【3】DIENSTAGJL,GOLDINRD,眦 ATHCEJ,eta1.Histologiealoutcomeduringlong-termlamivudinetherapy.Gastroen-temlogy,2003,124(1):10
24、5-117.【4SHIFFMANML,HOFMANNCM,COOSMJ,eta1.Amndomized,controlledtrialofmaintenanceinteifemntherapyforpatientswithchronichepatitisCvirusandpersistentviremia.Gastroenterology,1999,117(5):1164-1172.【5】UEBERHAME,LOWRUEBERHAMU,ettracycline-regulatedexpressionofTGF-betalinliveroft/alls-geniemiceleadstorever
25、sibleintermediaryfibrosis.Hepatdogy,2003,37(5):1067-1078.【6VAIDYAVS,SHANKARKLOCKEeta1.Molecularmecha-nismsofrenaltissuerepairinsurvivalfromacuterenaltubulenecrosis:roleofERK1/2pathway.ToxicolPathoL2003,31(6):6O4-618.【7TARNAWSKIAS,PAIRWANGH,eta1.TranslocafionofMAP(Erk-1and-2)kinasestocellnucleiandact
26、ivationofcfosgeneduringhealingofexperimentalgastriculcers【 J.JPhysiolPharmaco1.1998,49(4):479-488.【8】BLIKSLAGERAT,RHOADSJM,B 砒 s1LDG,eta1.Ghl-talnineandtransforminggrowthfactor-alphastimulateextracellu-larresultedkinasesandenhancerecoveryofvilloussurfaceareainporcineisehemic-injuredintestine.Surgery
27、,1999,125(2):186-194.【99 中华医学会传染病与寄生虫病学分会,肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案们.中华肝病杂志,2000,8(6):324 329.【9】ChineseSocietyofInfectiousDiseasesandParasitologyandChineseSocietyofHepatologyofChineseMedicalAssociationTheprogammeofpreventionandcureforviralh 印 8titis.ChineseJournalofHepatology,2000,8(6):324-329.Chinese【1o潘勤 ,陆良勇,李定国,等.生长抑素受体与肝星状细胞活化的相关性研究.中华消化杂志,2004,24(6):374 376.【10PANQ,LULY,LIDG,etaLRelationshipbetweensomato-
