1、氟对成纤维细胞增殖活性影响的剂量-效应关系方病学杂志 2005 年 9 月 20 日第 2 鲞第 LhinJEndemiolSep20,2005,Vol24,No.5氟对成纤维细胞增殖活性影响的剂量一效应关系井玲赵轶卓齐玲李广生?实验研究?【摘要】目的观察不同质量浓度氟在不同时间段对小鼠皮肤成纤维细胞株(L929)增殖活力的影响.方法采用四唑盐(Mrr)比色法 ,观察氟对培养的小鼠皮肤成纤维细胞增殖活力的影响.结果 0.001,0.002me,/L 氟作用 lh,0.001mg/L 氟作用 2h,可使成纤维细胞增殖活力较对照组明显增强.随着氟质量浓度的增加和氟作用时间的延长.成纤维细胞的增殖活
2、力明显减弱.结论氟在一定剂量范嗣内对成纤维细胞的增殖活力有刺激作用.这种作用亦受作用时间的影响.【关键词】氟化物;成纤维细胞;细胞培养中图分类号:O613.41 文献标识码:A 文章编号:1000 4955(2005)05051703Dose-effectrelationshipbetweenfluorideandproliferationacfityoffibroblastJINGLing,ZHA0Yi-zhuo,QtLing,LIGuang-sheng.DepartmentofPathology,InstituteofEndemicdiseases,JilinUnweni,Changchu
3、n130021,China【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectsoffluorideonproliferationactivityoffibroblastsindifferentdoseandatdifferenttime.MethodsMTI“colorimetrywasusedtodetectfibroblastproliferationactivities.ResultsFluoridesignificantlyincreasedfibroblastproliferationactivitiesincertainrangeofconcentration(
4、0.001,0.002mg/LF-)andatcertaintime(onehourandtwohouIs).Afterwards,theproliferationactivityoffibroblastwasdecreasedalongwiththetimeofcultureandtheincreaseofdosesoffluoride.ConclusionsThefluorideeffectontheproliferationactivityoffibroblastisdoseandtimedependent.【KeywordslFluorides;Fibroblasts;Cellcult
5、ureCLCnlllllbet:06l3.4lDocumentcode:AArticleID:l0004955(2005)05051703骨周软组织化骨是慢性氟中毒骨骼病变之一.主要涉及骨间膜,韧带和肌腱,是氟骨症患者致残的重要原因.骨周软组织的主要细胞成分是成纤维细胞及其前体.已知过量氟可激活成骨细胞.但氟化物对成纤维细胞的作用则尚缺乏系统研究.本实验将着重研究氟对成纤维细胞增殖活性的影响.探讨氟化物一成纤维细胞一氟中毒骨周化骨三者之间的相互关系.1 材料和方法1.1 成纤维细胞:小鼠皮肤成纤维细胞株(L929).1.2 主要试剂:DMEM 培养基(美国 Gibco 原装),胎牛血清(美国
6、Gibco 原装 ),胰蛋白酶(美国 Sigma原装),二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTF,美国 Sigma原装),氟化钠(NaF, 分析纯 ).1.3Mrrr 实验 :取 L929 小鼠皮肤成纤维细胞株 .置于含有 10%小牛血清的 DMEM 培养基中,37.基金项目:国家自然科学基金面上项目(30471498)作者单位:l3o02l 长春.吉林大学地方病研究所作者简介:井玲(1960 一), 女 ,吉林省长春市人,医学博士,教授从事代谢性骨病学,地方病学研究5%CO:及饱和湿度条件下培养.培养 3d 后,以 2x10 的密度种植于 75ml 培养瓶中.换含 5%/1,牛血清的 DMEM 培养
7、基继续培养.待瓶内细胞铺满80%左右时 .用 0.25%胰蛋白酶消化细胞.制成单细胞悬液.以每孔 104 个细胞密度接种于 96 孔培养板中,同样条件继续培养 3d.加氟培养共分 I2 个时间段,分别为 96,72,48,24,12,8,6,4,2,1h 和 30,15min.加入 MTI“前 4 小时实验组每LJJU 人含氟培养液,使 F 一终质量浓度为 0.001,0.002,0.O05,0.Ol,0.05,0.1,0.5,1,5,l0 和 20m.对照组使用基础培养基.每:fLJJn 入 MIT20l,继续培养 4h,终止培养,小心弃去孔内上清液,加入 150lDMSO,振荡10min.
8、使结晶充分溶解.酶标仪 490nm 处测定各孔吸光值(空白孔培养液中不含细胞,调零).1.4 统计学处理:实验结果采用非参数统计学方法(SPSS11.5 软件)2 结果2.1 各不同时间段和不同氟质量浓度对成纤维细胞增殖活性的影响:由表 1,2 可见,O.00l,O.002mLF 一作用 lh,可使成纤维细胞增殖活力明显增中国地方病学杂志 2005 年 9 月 20 日第 24 卷第 5 期ChinJEndemiol,Sep20,2005,Vol24,N0.5强:O.001mg/LF 一作用 2h,成纤维细胞增殖活力明长,成纤维细胞的增殖活力明显减弱.显增强:随着氟质量浓度的增加和氟作用时间的
9、延表 1 氟对小鼠皮肤成纤维细胞增殖活力的影响(15rain 一 6h)(五s)Table1Effectoffluorideontheproliferationactivityoffibroblast(15min6h)(五s)注:与对照组相比,活力增加程度 P0.05;与对照组相比.#活力减少程度P0.05;下表同表 2 氟对小鼠皮肤成纤维细胞增殖活力的影响(8h96h)(五s)Table2Effectoffluorideontheproliferationactivityoffibroblast(8h96h)(五s)2.2 不同质量浓度氟作用 lh 对成纤维细胞增殖活力的影响:由图 l 可见
10、.氟作用于成纤维细胞 lh时,O.00lmg/L 和 O.0o2mg/L 剂量组对成纤维细胞增殖活力有明显刺激作用,然后随着氟质量浓度的升高成纤维细胞的增殖活力受到抑制.氟质量浓度达到 O.05mg/L 和 O.1mg/L 水平时,成纤维细胞的增殖活力又有所回升,但未达到 0.001mg/L 和O.0o2mg/L 剂量组水平.2.3 不同质量浓度氟作用 2h 对成纤维细胞增殖活力的影响:由图 2 可见,氟作用于成纤维细胞 2h时,除 0.0olms/L 剂量组对成纤维细胞增殖活力有明显刺激作用外,其他各组均呈抑制作用.3 讨论氟对成纤维细胞的作用研究不多,且多着眼于毒性作用的研究.早年 Sus
11、heela 等发现氟离子能抑制胶原的生物合成,认为胶原是氟化物作用的靶子,但其工作并未涉及胶原生成细胞.近年来 Jeng等_2 报道 4mmol/LNaF(相当于 76mg/L)2h 可抑制成纤维细胞蛋白合成,细胞 ATP 水平和线粒体功能亦随氟化物呈剂量相关关系:4,8,12mmol/L.NaF 可分别抑制线粒体功能 3l%,56%和 57%;低于 2mmol/L.NaF 孵育 2h 未见明显变化;培养液中加入丙酮酸和琥蕃酸不能纠正氟所致的细胞 ATP水平降低.Veron 等 E3在培养人牙髓成纤维细胞的国地方病学杂志 2005 年 9 月 20 日第 24 卷笠 5 期_n!:PQ:212
12、:蝗锻磐图 l 不同质量浓度氟作用 1h 成纤维细胞的增殖活性Fig1ProliferatoinactivityofFibroblastsculturedwithfluorideindifrerentdoseforlhour培养基中分别加入 0,1,10,25mLNaF,发现当氟剂量达到 25mg/L 时可抑制细胞生长,ALP 活性亦随 NaF 剂量增加而降低:并通过免疫组化,放免及 I型,型胶原 mRNA 水平检测等手段发现 NaF 抑制胶原合成和基因表达(主要影响 o【I),但纤连素生成和基因表达未受影响.OguroI 亦发现 FL 达 20mg/L 时二倍体细胞不能存活,超过 2mg/L
13、 时细胞生长受到明显影响.本实验检测了不同质量浓度氟在不同时间段对成纤维细胞增殖活力的影响.结果表明,氟对成纤维细胞增殖活力的促进作用具有时问和剂量的依赖性.在氟作用 1h 时,0.001,0.002mg/L 氟组对成纤维细胞增殖活力有明显促进作用:氟作用 2h时.只有 0.001mg/L 氟组明显刺激成纤维细胞的增殖活力:随着氟作用时间的延长,成纤维细胞的增殖活力随氟剂量的升高有所下降,至 5,1O 和 2Omg/L 剂量时增殖活力较对照组明显下降.Kawasei亦在研究中发现长期暴露 F 一(1mmol/L,相当于19rag/L)可导致 F 蓄积,抑制小鼠皮肤成纤维细胞(L929)增殖:而
14、短期暴露 F 一(1mmol/L)反而可以刺激成纤维细胞的增殖.根据以往文献报道和本实验的研究结果,明显看出氟对成纤维细胞的作用呈剂量一效应关系6j:适宜的较低浓度氟对成纤维细胞的增殖呈明显促进作用.随着氟剂量的增加,这种刺激作用消失,毒性作用开始逐渐显现:当氟达 5,1O 和 20mg/L 时,成纤维细胞的活性受到明显抑制,符合“Hormesis“效应.同时这种剂量一效应关系亦受作用时间的影响.即氟作用时间在 12h 时,呈明显的 Hormesis 效应:随着时间的延长,兴奋效应逐渐由毒性效应取代.这个结果和我们以前研究氟影响成骨细胞增殖活力的变化趋势大体上相似,均表现为低剂量时兴奋一高剂量
15、时抑制7-10,但在染氟剂量和作用时问上二者又有显着不同.对于体外培养的成骨细胞,染O0.0020.0100.0500.50010.O00F(wIg/L)图 2 不同质量浓度氟作用 2h 成纤维细胞的增殖活性Fig2ProliferationactivityofFibroblastsculturedwithfluorideindifferentdosefor2hour氟在一个较大的剂量范同(1.O4.0mF 一或更高)和一个较长的时间范围(2472h)内,对成骨细胞主要是起刺激增殖作用.这种差别提示氟化物促进成骨细胞增殖具有其特殊针对性,而对成纤维细胞的作用则更像是机体细胞对毒物的一般反应.对
16、于这一点,我们进一步的工作正在进行.因此.在研究氟骨症骨周化骨机制中,我们不仅要重视氟对成纤维细胞的作用,更要重视成纤维细胞的前体.即肌腱,韧带等部位的问充质干细胞,它们更可能成为过量氟直接或间接作用的靶细胞.参考文献lSusheelaAK.ShamaYD.CertainfacetofFactiononcollagenproteininOSSEOUSandnonosseoustissueJ.Fluoride,1982,15(4):170190.2JengJH,HsiehCC,LanWH,eta1.Cytotoxicityofsodiumfluorideonhumanaralmucosalfib
17、roblastsanfitsmechanismsJ.CellBiolToxicol,1998,14(6):383389.3VeronMH,CoubleML,MagloireH.SelectiveinhibitionofcollagensynthesisbyfluorideinhumanpulpfibroblastsinvitroJ.CalcifTissueInt,1993,53(1):3844.4OguroA,CervenkaJ,HoriiK.EffectofsodiumfluorideongrowthofhumandiploidcellsincultureJ.PharmacolToxicol
18、,1990,67(5):414l_4l44.5KawaseT,SuzukiA.StudiesonthetransmembranemigrationoffluorideanditseffectsonproliferationofL 一 929fibroblasts(Lcells)invitroJ.ArchOralBiol,1989,34(2):103107.6 李广生,井玲.关注氟化物的剂量一效应问题 fJ.中国地方病学杂志,2004,23(2):l 一 27 刘晓秋,李广生.氟化物对骨形成中成骨细胞的影响及机制J.中同地方病学杂志,2000,19(5):394 395.8 刘晓秋,孙波,李广生.氟化物对体外乳鼠颅盖骨分离细胞活力的影响J.白求恩医科大学,2001,27(5):464.466.9 丽莎,高申,华坤,等.氟时体外培养的小鼠成骨细胞的增殖活力的影响J.中田地方病学杂志,2003,22(6):495497.1O 许骏,陈建伟,蔡红梅,等.氟对鼠成骨细胞 BMP 表达的影响及锌的拮抗作用J.中圜地方病学杂志,2004,23(2):l13 一 l15.(收稿日期:20041021)(本文编辑: 罗志忠)
