1、植物在鼠疫菌保存和传播中的某些作用第 16 卷2001第 4 期11 月地方病通报ENDEMICDISEASESBULLETINVo1.16.NO.4Nov.2001文章编号:10003711(2001)04 一 oooi 一 04植物在鼠疫菌保存和传播中的某些作用.柬志忠,顾峰,杨桂荣,申晶,于晓风.,于晓冬.(1.全国鼠疫布鲁氏菌病防治基地.吉林白城 137000;2.吉林省白城市农业科学院,吉林白城 137000)摘要:在实验室条件下用鼠疫苗接种菊科,豆科和禾术科的某些植物 ,第 5d31d 用PCR 技术从紫苜蓿,胡枝于,苗陈蒿的根卫大豆的根,茎,叶中扩增到鼠疫苗特异 DNA 片段.第
2、 10d 和第 20d 从大豆根中分离到鼠疫苗.鼠疫苗的菌落形态发生丁 RS 变异+毒力有所增强,同时营养需求也发生丁变化 .用染菌植物喂养豚鼠.第 12d 用放射免疫沉淀法检谢血清 t鼠疫苗特异抗体滴度达 1t320.认为某些埴物具有充当鼠疫菌自然宿主和传播媒介的可能.关键词:植物;鼠疫苗;作用中圈分粪号:R378.61iQ948.122.3 文献标 tR 码:ASomeFunctionofPlantsinthePreservationandSpreadofY.pestisSONGZHizhong,GUFeng,rANGGuirong,eta1.(ChineseBaseforControlo
3、fPlagueandBrucellosis,Baicheng,Jilin137000,China)Abstract:SomeplantsofAsteraceal,Compositae,FabaceaI,PapilionaceaandPoaceae,Gramineaewereinoculatedunderthelaboratorycondition.ThespecificamplifiedDNAbandsweredetectedbyPCRtechniqueintherootsstemsandleavesofMedocagostativa,LespedezabicolovandArtemisiac
4、apillarisafterinocutationfrom5thdayto31stday.ThestrainofY.pestiswasisolatedintherootofGlycinemaxatthe10thdayand20thdayafterinoculation,respectively.TheshapeofthecoloniesofY.pestisshowedRSvariation.Andthevirulenceofthestrainwasgottenamplified,Atthesametime,thenutritionrequirementchangedtoo.Theinfecte
5、dplantswereusedtofeedguineapig.TheserumofthepigswasdetectedbyRIP.Thetiterofthespecificantibodywasupto1l320,ItisbelievedthatSOU!eplantsprobablyplayrolesasnaturehostandmediumofspreadofY.pestis.Keywords:Plant;pestis;Function目前已经证实,健康植物体的组织,器官中含有多种非病原菌和某些条件致病菌 L1.但关于对植物,动物和人都致病的细菌研究的很少.有资料表明,绿脓杆菌(Pseudo
6、monasaerugenosa)对哺乳动物和鸟类及植物如莴苣,烟草,香蕉等致病.李斯特菌可在植物提取物中生长.从白菜,葱,葫箩中分离到 Yersiniapseudotuberculosis.BAropaefio 等趴多年生草本植物组织中分离到 Y.enterocolitica 和 Y.intermedia,并认为植物是其宿主.我们在实验室条件下对植物在鼠疫菌(y.pestis) 保存和传播过程中的某些作用进行了?收稿日期:20000404I 酱回日期;20010724基盒项目:吉林省卫生厅青年科研基垒资叻疆目(98589)作者筒升 t 朱志忠(1966 一).男,医学博士,副主任医师.?1?研
7、究,报道如下.1 材料和方法1-1 材料 :(1)菌株:Y.pestis061, 中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所鼠疫室提供.(2)植物:大豆 (Glycinemax),小麦(THticumacstivum)购于本市种子公司.紫苜蓿(Medicagostativa),胡枝子(Lespedezabicolov),茵陈蒿(Artemisiacapillaris)采自本单位院内.2 地方病通报 16 卷(3)实验动物: 昆明系纯种小白鼠 ,体重 1820g.豚鼠体重 250300g,均购自白求恩医科大学实验动物中心.(4)聚合酶链式反应(PCR)试剂盒由军事医学科学院微生物学流行病学研究所提
8、供.1.2 方法:(1)植物的培养和接种 J:大豆和小麦种子经表面灭菌分别用培养液和土壤培养,种子种植后 47d 开始发芽,此时将活化的鼠疫苗稀释至 10“cfu/L,向培养液中注入菌液 0.1mL/管(每株一管,每管培养液10mL),向土壤注入 ImL/管 (每管 50g 土壤),接种后置于 2O左右无菌室内紫苜蓿,胡枝子和茵陈蒿自室外移植,采取茎局部灭菌,用手术刀片在茎部表皮划割 0.25cm,并将蘸足上述菌液(约 1mL)的灭菌脱脂棉用胶布固定于伤处,接种局部用透明塑料膜加以保护.(2)植物不同器官样本采集 0:自接种后第 5d 开始,每隔 57d 进行采样用灭菌剪刀剪取叶,茎,根各约
9、0.5g,用自来水分别冲洗 10min,震荡水洗 3 次,每次 5mln,依次浸入 95 乙醇 1mln,含 50 乙醇的 3次氯酸钠消毒液浸 5min,无菌水震荡洗 3 次,每次5min,用无菌乳钵研碎,加 5mL 生理盐水,用于细菌培养及 PCR 检测.(3)PCR 检测按文献 4进行用 NaI 裂解玻璃耪吸附法提取模板 DNA.(4)分离菌株的生物学特性按文献5 进行.(5)鼠疫苗质粒检查按文献6 进行(6)鼠疫苗植物感染动物按文献7 进行.(7)鼠疫苗抗体用放射免疫沉淀试验(RIP)和间接血球凝集试验(IHA)检查.2 结果2-l 蛔茵培养度 PCR 检测结果;用鼠疫菌以不同途径接种植
10、物,不同时间对植物各器官进行细菌培养和PCR 检测,由于实验条件所限,本次实验观察期限为31d,结果见表 1.裹 l 檀袖:F 同器官鼠疫蕾培养殛 PCR 檀蔫结果Table1TheresultofPCRdeW.IonandbacteriacaltureofY.pesr/fromdifferent0qnsofplants注:“+“指培养或 PcR 阳性 CultureorPCRpositive;“一 “指培养或 PCR 阴性CultureorPCRnegative;“*“经土壤培养接种I#ocuationthrou 曲 so“*“经茎划伤接种 Inoculationthroaghstems;牛
11、*“经水培养接种 lnocuhitionthrOuwater4 期宋志忠,等.植物在鼠痘苗保存和传播中的某些怍用 32.2 分离茵株的生物学特性(注:菌号 061 为原株612 为接种第 2od 自大豆根中分离;613 为接种后第 lOd 自大豆根中获得)(1)菌落形态: 将 3 株菌在营养琼脂平碟及赫氏肉汤中 28培养.o61 株 24h 在营养琼脂平碟上菌落呈粗糙颗粒状,色淡,中央昏暗,周边较明亮,有锯齿状花边.在肉汤中 72h 形成菌膜及沉淀,肉汤清,可见钟乳状发育,呈典型 R 型特征.而 612,613 株 24h 平碟上菌落光滑,圆而隆起,边缘整齐,色淡,肉汤中呈均匀浑浊,无菌膜及钟
12、乳状发育,呈 S 型特征.(2)原株及从大豆根中分离的菌株都含有分子量分别是 6,45,52Mdal 质粒.产生 F1,Vw 抗原,37钙依赖,产生鼠疫杆菌紊 1(Pstl),无色素吸附能力(Pgm 一 ).(3)生化反应所有实验菌株都发酵阿胶糖,葡萄糖,甘露醇,甘露糖,水杨紊,术糖,果糖,甘油.不发酵蔗糖,山梨醇,密二糖,菊糖,麦芽糖,山梨糖,乳糖,松三糖,鼠挛糖.脱氟阳性,不分解尿素.(4)营养需求:061 和 613 株表现对 Phe,Met,Cys 依赖.61 2 株表现对 Phe,Met,Cys,Thr,Leu,Trp,Glu,Ile,Arg,Val,Gly 等 种氨基酸都不依赖.将
13、其通过 3 代小白鼠,又恢复对 Phe,Met,Cys 依赖.(5)毒力测定:061 株 LD5o 为 9.0710cfu,613株为 25310cfu,612 株为 2.5810cfu061 株的 LD.是 613 株的 3.58 倍,是 612 株的 35.16 倍.2.3 染茵植物喂养朦鼠的鼠疫茵 F1 抗体拴查结果:见表 2.衰 2RIP 和 IHA 检验血清 Fl 抗体结果Table2TherultofF1antibodydetectionbyRIPandIHA喂养天数Inoculation 血清浦度抑制实验(d)S 町 l1mt 目 hhIb“i.I1IHA对照血清滴度对照Cont
14、rolserumtiterCntrol注:“+“阳性 Positive“一“阴性 Negative3 讨论鼠疫动物病的发生与流行机制,至今仍是一个来解之谜.经过多年研究,大量资料表明,鼠疫动物病确实存在着流行间期,这种间歇期不仅表现为季节性,还表现年际特点,甚至长达数年,数十年之久.这对传统上认为鼠疫苗在啮齿动物宿主和媒介昆虫间不间断循环,鼠疫始终在啮齿动物间流行,只不过当流行范围很小(微小疫源地) 或来波及到人间时我们投发现罢了“ 的观点提出了挑战.因此 ,如何合理解释为什么鼠疫会经过一段静息后,又在同一地区(自然疫源地)突然出现,而且在并无相干的地域同时出现等现象,便成为关注的焦点.解决这
15、些问题的关键在于首先弄清鼠疫间歇期病原菌在何处,以何种方式保存.关于这一点,有过很多学说,具有代表性的有:“流行保存“(鼠蚤鼠循环保存),包括“飘忽不定式“ 和“固着式“(微小疫源地 );“土壤保存“变异保存“,包括 L型,腐生型变异;“寄生“ 保存,包括啮齿动物慢性感染,在蚤,蜱,螨,及土壤原生动物体内保存;“静息“ 保存,即在不良条件下失去繁殖能力和在培养基上生长的能力(非培养状态), 但保留最低的新陈代谢,保持毒力并能在一定条件下返祖(与芽孢的功能相似).但这些学说,只能就某些现象而不能对上述具体问题作出全面合理的解释.无论鼠疫菌在何处保存,首先必须不断地供给其必需的营养成分,能保证种群
16、存在及种族延续性鼠疫动物病是一个生态系统,各种生态因子都有自己的功能.以往关于鼠疫菌保存学说都基于动物宿主,昆虫媒介,及土壤等.而这些都不能长期不断地供给鼠疫菌所必须的营养成分,不是鼠疫菌最佳“l 丑宿“. 这就使我们想到,作为鼠疫生态系统的重要生物因子之一的植物是否具备这些基本条件呢?首先,作为生态系统的生产者植物具有所有草食性动物所必需的蛋白质,糖类,水,维生紊等营养物质,而这些物质也同样适合于鼠疫苗的生存.1o.3.PnaKyc 等对中亚荒漠疫源地的植物进行了分析,证实某些植物含有该疫源地鼠疫苗所必需的各种氨基酸,维生紊等营养成分口.鼠疫苗具有如过氧化氢酶,细胞色素氧化酶,核糖核酸酶,纤
17、维蛋白溶解酶等酶系统,完全可以利用植物提供的营养成分在实验中,为了避免污染所造成的假阳性,我们用植物不同器官沾取实验浓度菌液,室温 2h 后,通过本文 1.2 中方法(2)分别处理,经细菌培养和 PCR 检查,结果为阴性.用传统的细菌培养来能从经茎划伤接种的茵陈蒿,胡枝于和紫苜蓿分离到鼠疫苗,但第 10,20,31d(观察期限为 31d)从经茎划伤接种的胡枝于,紫苜蓿,和茵陈蒿(从第 5d)根中扩增到了鼠疫菌特异 DNA 片段.而接种部位的茎,只在接种后第 5dPCR 呈阳性结果,后转阴.由于接种部位是茎(地上部分),而根位一一一一一一一一一一一一+OO62001388;1忱“ 札4 地方病遥
18、报】6 卷于地下部分,又经过严格的样本处理,可以排除表面污染的可能性.因此可以推断鼠疫菌经茎通过输导组织主要进入根并在其中定居.鼠疫苗主要定居于根中,可能是由于根更能保证稳定的小环境,如温度,湿度,酸碱度,和营养物质供应.分离不到鼠疫菌可能是由于局部器官中菌量步,也可能鼠疫菌在这种环境中处于所谓的“ 静息状态.在接种后第 lOd 和第 20d,从经根接种的大豆根中分离到鼠疫菌.自第 5d 起至第 3ld(观察期限为 31d),均从大豆的根,茎,叶中扩增到了鼠疫菌特异 DNA 片段.又说明鼠疫菌可以从根进入植物的茎和叶.研究结果表明,在实验室条件下鼠疫苗可以进入菊科,豆科某些植物器官中.鼠疫苗通
19、过植物后某些生物学特性发生了变异,菌落形态呈 RS 改变,毒力有所增强 .这是由于鼠疫菌经植物再感染动物时,生存环境发生了转换,鼠疫苗和新的环境要有一个适应过程,主要表现为鼠疫苗对动物的毒力,动物对鼠疫苗的感受性和敏感性.鼠疫苗在植物体内经过 2od 后变异为对包括Phe,Met 和 Cys 三种鼠疫苗必需氨基酸在内的 l1 种氨基酸都不依赖的营养缺陷型这种缺陷型表现不稳定,经 3 代动物可恢复到原株状态.营养缺陷型的出现说明在植物环境中鼠疫苗摄氮途径(方式)更加广泛,这似乎预示着鼠疫苗可能存在着.非寄生状态“.动物摄食感染以为许多研究者所证实“,被认为是在公认的虫媒传染途径之外,动物间感染鼠
20、疫的另一种方式.现已证明褐家鼠,沙土鼠,猴,鼬类,山猫,狗及藏系绵羊等通过摄食而发生了鼠疫.鼠疫苗在pH4.0 的胃酸里仍可存活,并能够穿透胃肠粘膜而引起感染.我们用实验室感染鼠疫菌的植物(大豆)喂养豚鼠,第 7d 用放射免疫沉淀试验测得鼠疫苗特异抗体滴度为 1t160,第 12d 可达 1:320,第 21d 仍保持在1;80 水平.需要说明的是我们的实验是在实验室条件下进行,由于实验条件所限,观察期限只有 3ld.另外,在实验室条件下由于人为构造植物微生态环境,鼠疫苗进入植物器官可能受人为因素的影响,在自然条件下要复杂的多.不同植物的微生态因素及鼠疫苗生态因素都影响着鼠疫苗与植物问这种关系
21、的形成.所还不能得出植物能长期保存鼠疫菌的结论.但从我们所进行的初步研究获得的结果看,某些植物在鼠疫这个生态系统中具有充当鼠疫菌的自然宿主和传播媒介的可能.鼠疫菌存在于某些植物(多年生)根系中,通常可能处于“ 静息状态“ 或“非寄生状态“,当自然界某些因素发生变化时,激发鼠疫菌进入植物地上部分并通过摄食途径使啮齿动物感染并引发动物间的传播.当然这一推论还需进行大量的实验室和野外实验的证实,这将对揭开鼠疫诸多之谜开辟一条新途径,为进一步科学地认识鼠疫奠定基础.参考文献:1鲁紊云,植物病害生物防治学M.北京:北京农业大学出版社.1993.Z5.2pBA.II“llIJjipKymUmH3nlaHe
22、w 印曲 HHnBArp.HeM.1990.23.33 宋志忠 .顾峰 t 栖桂荣.等用 y.pestis 接种某些植物的研究J. 中国地方病防治杂志.1996.11(4):l94196.4厘峰,申晶 .张贵军,等.用 UDPE 技术检测感染鼠疫苗植物J. 中国地方病防治杂志,ZOO0,15(4):2O8 209.5宋志忠,扬桂荣 ,申晶.等鼠疫苗通过植物后某些生物学特性的变异 D.地方病通报.1997,12(1):1618.6宋志忠,阎闯 ,张贵军,等鼠疫苗特异性质粒快速检测方法的研究J.中国地方病防治杂志,1994,9(5):262263.7顾峰,申晶 ,宋志忠,等.感染鼠疫苗的植物作为传
23、染源的研究口.中国地方病防治杂志,1998,13(3):139 140.8SuchkovYuG,KhydyakovIV,EmelyanenkoEN,a1.OnthepossbUityofthepreservationofY 矗晡 npenisinthelatent(nonculturable)formJZhMkrobiol,1997,4:4246.9P.sKycl.8,M叩 bcKnOB,BC,4KapeBBM,n2.p.yH蹦 P 州 n 砧 H00rKaKEbM0HKONnOHeTvM 肿apa3 耵 Due眦J.Bm 册 .Mock06Ba14cnlgaTplfpHor 且 60+1993,98(1):313.103 张洪翊 ,黎占海,张文仁,长爪抄鼠实验鼠疫检查方法柯抗体动态观察A. 鼠疫论文专集 c.北京:中华流行
