1、端粒植入胃癌 7901 细胞对细胞生长、端粒和端粒酶的影响第 12 卷第 1 期2008 年 3 月生命科学研究LifeScienceResearchVol|12No.1Mar.2008端粒植入胃癌 7901 细胞对细胞生长,端粒和端粒酶的影响巩艳.一,房殿春,罗元辉,张汝钢(1.第三军医大学附属西南医院全军消化病研究所,中国重庆 400038;2.解放军 401 医院消化科,中国山东青岛 266071),摘要:研究外源端粒片段植入胃癌 7901 细胞后对细胞生长 ,端粒长度和端粒酶活性的影响.采用 lipofect2000介导的转染方式.将舍有端粒片段质粒 pSXneo-1.6-T2AG3
2、转染胃癌细胞SGC7901.PCR 在基因水平上鉴定外源性端粒片段的植入后,采用 TRAP 法检测转染细胞端粒酶活性变化,TRF 法检测转染细胞端粒长度变化,MrITr 法检测细胞生长曲线,RT.PCR 测定转染细胞 hTERT 表达变化.染色体核型分析细胞染色体变化.结果显示端粒片段成功导入 SGC7901 细胞后获得稳定的细胞株.端粒片段植入后细胞生长变慢,端粒长度延长不明显,端粒酶活性明显降低,hTERTmRNA 表达水平下降,核型分析显示转染前后细胞染色体数目无明显变化.实验成功将携带了 1600bp 端粒 TrAGGG 重复序列的真核表达栽体 pSX.T2AG3.neo 稳定转染至人
3、胃癌 7901 细胞中,端粒植入降低细胞端粒酶的活性和下调端粒酶活性亚单位 hTERT 的表达.但对端粒长度无明显影响.关键词:端粒植入;端粒酶;端粒长度中图分类号:R394 文献标识码:A 文章编号:1007.7847(2008)01.O082.05TelomereSeedingtoGastricCancerCellLine7901anditsEffectonCelIGrowth.TelomereandTelomeraseGONGYan1,2FANGDianchun1,LUOYuanhui1,ZHANGRugang(1.DepartmentofGastroenterology,Southwe
4、stHospital,TheThirdMalloryUniversity,Chongqing,400038,China;2,DepartmentofGastroenterology,401HospitalPLA,Qinga266071,Shandong,China)Abstract:Tostudytheeffectsoftelomereseedingingastriccarcinomacell7901byobservingthechangesofcellbiologicalbehaviours,telomerelength.telomeraseactivation.TheplasmidpSX.
5、T2AG3.neowithtelomerefragmentwerepreparedandthentransfectedtogastriccancercellSGC7901byLipofectamineTM2000,PCRwaspreformedtoverifyi.thestableseedingoftheexogenoustelomerencellTelomeraseactivitywasdetectedbyTRAPandtelomericrestrictionfragment(TRF)wasmeasuredbySouthernblot.MI1“aassaywasusedtodetermine
6、cellgrowth.mRNAexpressionofhTERTwasdetectedbyRTPCRandchromosmechangebychromosmekaryotypeanalysis.TheresuhsshowedthattelomerefragmentsweretransfectedintogastriccancercelllineSGC7901andthestablecellstrainWasobtained.cellproliferationwasobviouslydecreased,telomerelengthhasnosignificantchange,relativete
7、lomeraseactivitywassignificantlylower,theexpressionofhTERTmRNAwasdecreased.Thenumberofchromosomeshavenodirence.Inthisexperience,thepSXT2AG3 一neoeukaryonicvectorintertedwithl600bptelomereTIAGGGfragmentswassuccessfullytransfectedintogastriccancercelllineSGC7901withthehelpofLipofectamineTM2000.Thetelom
8、eraseactivitywasdecreasedandTRFWasnotinfluenced.Keywords:telomereseeding;telomerase;telomerelength(LireScieitceResearch,2o08,l2(1):082-086)收稿日期:2007.0710;修回日期:2008.0201基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270609)作者简介:巩艳(1977 一), 女 ,山东淄博人,第三军医大学主治医师,博士,主要从事胃粘膜癌变的分子机制研究;房殿春(1951.),男,吉林长春人,第三军医大学主任医师,教授,博士生导师,通讯作者,主要从事
9、胃粘膜癌变的分子机制研究,Tel:023.68754480,E mail:.第 1 期巩艳等:端粒植入胃癌 7901 细胞对细胞生长 ,端粒和端粒酶的影响 83端粒与肿瘤发生发展的关系是近年来医学研究的热点之一.端粒长度的维持,是细胞永生化和无限制增殖的基础.端粒酶延长端粒长度,已在几种细胞发现端粒能够植入并形成稳定转染体,其间需要端粒酶的作用.但是端粒的植入对整个染色体的影响及对端粒酶活性影响还未见报道.由于在端粒酶存在条件下,外源端粒转染细胞后能够形成稳定染色体,使得人们能对基因组进行操纵,进行染色体绘图等,进一步揭示人类基因组的秘密.端粒长度和端粒酶活性的改变是细胞基因不稳定及恶性化的基
10、础.有鉴于此,我们采用基因转染方法将端粒植入胃癌细胞,观察外源端粒植入对细胞生长,染色体,胃癌细胞端粒长度和端粒酶活性的影响,藉以探讨端粒在胃癌发生发展中的意义.1 材料与方法1.1 材料TripureRNA 分离试剂盒,逆转录试剂盒,购自 Promega 公司,限制性内切酶购自 Bidab 公司,Taq 酶购自 Promega 公司,PCR 引物由上海生工合成,凝胶回收试剂盒购自 Qiagen 公司,脂质体转染试剂购自 Invitrogen 公司,G418,RPMI1640培养基购自 hyclone 公司,细胞 DNA 提取试剂盒购自华美公司,其余试剂均为国产优质分析纯.pSXneo 一 1
11、.6 一 T2AG3 质粒由美国洛克斐勒大学 TTLange 博士惠赠 ,含有 1.6kb 大小的端粒TrAGGG 重复序列和 neo 筛选基因(neo 序列参考 Stratagene 公司质粒 pMC1neopolA).XL1 一 Blue菌种和胃癌 SGC7901 细胞株均为本实验室保存.1.2 方法1.2.1 质粒扩增和纯化采用经典氯化钙方法将质粒转化大肠杆菌XL 厂 Blue,筛选出阳性克隆,小量抽提质粒,质粒DNA 经 Bgl单酶切,nI 和 Bgl双酶切,琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,然后按常规方法大规模抽提质粒.1.2.2 细胞培养SGC7901 细胞置于 37,饱和湿度,含 5%CO
12、2 的孵箱中培养,培养液 RPMI1640 含 100mL/L胎牛血清,100kU/L 青霉素和 100mg/L 链霉素.根据细胞生长状况每 23d 换液 1 次,当细胞生长状态稳定,呈对数生长期,用于实验.1.2.3 转染细胞将培养的 SGC7901 细胞接种到 6 孔细胞培养板上,24h 后待细胞密度达到 80%90%左右时,将待转染质粒和脂质体分别用 OPTIMEM 稀释后,混匀,室温放置 30min,加入细胞培养液中,补加低血清培养基,培养 24h 后,换有血清培养基,同时加入 G418(终浓度 500mg/L),以后每23d 更换培养基一次,同时加 G418 筛选,直至克隆形成.1.
13、2.4 鉴定抽提细胞 DNA,采用 PCR 技术扩增外源 ueO基因.ueO 引物序列参考 Stratagene 公司质粒pMC1neopolA,采用软件 primer5,由上海生物工程技术服务有限公司合成.引物序列如下:上游引物:5-CAAGATGGA 兀CACGCAGG 一 3;下游引物:5-CTGCTCAAGAAGACTCGCCC 一 3,长度 790bp.1.2.5 细胞生长曲线变化(Mrr 法)1.2.6 端粒长度检测 fSouthernblot),提取细胞基因组 DNA,Hae11I,HinfI,CfoI酶切基因组 DNA,3zpATP 标记合成的(TrAGGG)寡核苷酸探针 ,S
14、ephadexG50 柱纯化,探针与经酶切后的基因组 DNA 在 98变性 6min,55C 杂交 8h,杂交产物在 0.7%琼脂糖上电泳30min,凝胶干燥,与胶片共放在增感屏中,-70曝光 48h,洗片,结果经本所 BioRad 扫描分析仪进行积分光密度扫描,端粒限制性片段长度(TRF)按以下公式计算:平均 TRF=A/(A/厶),A 为 i点的吸光度值,厶为 i 点的 Marker 长度.1.2.7 端粒酶活性检测胰酶消化细胞,离,弃上清,冰冷的洗涤缓冲液 500L 悬浮 106 细胞,离心,收集细胞,进行端粒酶活性检测(TRAP 法)4J.加入 20 冰冷的裂解缓冲液裂解细胞,冰上孵育
15、 30min;100000g 离心30min,4.上清移人另一 Ep 管中,立 IP-7ooC 冻存备用.采用 bradford 法进行蛋白定量.设计引物:11S 序列 5 一 AATCCGTCGAGCAGAG 兀 3,CX 序歹5-CCC 兀ACCC 兀ACCC 兀ACCCTAA.3,经 PCR 扩增端粒酶提取物,反应体系:含引物CX 序列 1L(100g/L),2xTRAP 反应液 25L,提取物 2L,dNTP1txL10mmol/L,Taq 酶1txL5IU/txL,MgC121L125mmol/L,_32pdCTP0.2L,加 DEPCH20 至总体积 49L.短暂离心,23oC,3
16、0min,加人 CX 弓 J 物(100g/L)1生命科学研究 20o8 年tzL,PCR 反应在 0.5mL 的 Ep 管中进行,用GeneAmpPCRSystem2700 扩增.PCR 反应参数为 94预变性 10min,94变性 1min,梯度PCR 从 58开始到 51结束退火 30S,72延伸 1.5min,各 1 个循环后,94变性 1min,50退火 30S,72 延伸 1.5min,27 个循环.取 2OL 扩增产物在 12%t变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,扩增产物放射自显影.图像扫描仪扫描 x 光片,用分子生物学图像分析系统测定各条目的带积分灰度值,所测结果为扣除背景的积分光密度
17、,然后将各样本对应的条带取均值,作为此样本的相对端粒酶活性.1.2.8hTERTmRNA 表达检测采用 TriPureisolationreagent(Roche 公司)提取细胞总 RNA,提取方法按说明书进行,采用RT.PCR 方法检测提取 mRNA 表达情况.RNA 在紫外分光光度计上测 A 值和 A/A 瑚比值,确定所提取 RNA 的浓度和纯度.采用 2OL 逆转录反应体系:含待测总 RNA2g,AMV 反转录酶 5U,RNA 酶抑制剂 2OU,4 种 dNTP 各 0.5mmol/L,5逆转录缓冲液 4tzL,Oligo(dt)181tzL.42反应 60min 合成 eDNA 第一链
18、.PCR 反应体系为 2OL,内含 10xPCR 缓冲液 2tzL,4 种dNTP 各 0.25mmol/L,Taq 酶 1.5U,eDNA1tzL,上下游引物各 0.5pmol/L.内参照 GAPDH 上下游引物各 0.5Imol/L.PCR 引物参照文献合成,引物序列见表 1.PCR 反应在 0.5mL 的 Ep 管中进行,用 GeneAmpPCRSystem2700 扩增.PCR反应参数为 94预变性 4min;94变性 1min,6O退火 1min,72延伸 1.5min,33 个循环.扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳.对扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析.表 1 引物序列Table1
19、Il-lllllelsequences1.2.9 细胞基因组染色体的制备取传代后 24h 生长旺盛细胞,加入秋水仙碱(终浓度 0.004mg/L)作用 3Oh 水平拍打培养瓶壁,将细胞转移 15mL 离心管中,1000r/min 离心 10min 收集细胞;加入 10mL 低渗液(75%氯化钾)37 低渗 30min;加入 1mL 新配制的固定液(甲醇 :冰乙酸=3:1),轻轻混匀 ,预固定 5min;离心 1000r/min,去上清,加入 10mL 固定液,固定 23 次,每次 30min;滴片,风干,置一 2O保存备用.2 结果2.1 质粒鉴定pSXneo.1.6-T2AG3 质粒经 Bg
20、lII 单酶切线性化后,可见大小为 5411bp 的片段,经 KpnI 和BglII 双酶切,琼脂糖凝胶电泳后出现 1940bp和 3471bp 大小两个片段,与质粒图谱所示完全一致.图略.见参考文献63.2.2 克隆筛选及鉴定经筛选 2 周后,可见有克隆形成.转染有端粒质粒的克隆命名为 7901.telo,转染空载体的克隆命名为 7901.neo.采用 PCR 法扩增外源性 Neo基因片段(见图 1).转染有端粒片段和空载体的7901 细胞可见一条特异性的扩增条带,大小为790bp 左右,而未转染的细胞则未见特异性扩增条带.l234图 1NeoPCR 产物Fig.1NeoPCRproduct
21、1:7901;2:7901?telo;3:7901?neo;4:100bpDNAMarker-H2.3 细胞生长曲线的变化从第 2d 开始,细胞生长速度较未转染细胞减慢,倒置显微镜下 7901.telo 细胞失去重叠生长的能力,有接触抑制,而 7901 和 7901.neo 细胞重第 1 期巩艳等:端粒植入胃癌 7901 细胞对细胞生长 ,端粒和端粒酶的影响 85叠生长显着.2.4 端粒长度的改变采用 TRF 方法测定端粒长度,经 BioRad 扫描分析仪进行积分光密度扫描,端粒限制性片段长度(TRF)按上述公式进行计算后,7901 细胞端粒长度是 5.3kb,7901 一 telo 细胞端粒
22、长度是 5I4kb,7901 一 neo 细胞端粒长度是 5.3kb,3 组细胞并无显着差别(见图 2).】2342396422图 2TRF 方法测定端粒长度rig.2TelomerelengthassaybyTRFmethodshMWmarker;,2:7901-te1o;3:7901 一 neo;4:7901.2.5 端粒酶活性检测结果采用 TRAP 法检测相对端粒酶活性,将端粒酶扩增产物放射自显影.图像扫描仪扫描 x 光片后,显示端粒酶为相隔 8bp 的多条条带,最小相对分子质量 5Obp,用分子生物学图像分析系统测定各条带积分灰度值并取条带均值,作为相对端粒酶活性进行比较.结果如下所示
23、,7901 一 neo,7901,7901 一 telo 相对端粒酶活性值分别为(246.334.73,2532,2002.08),7901 一 telo 细胞相对端粒酶活性较前两种细胞显着降低(P0.05)(见图 3).图 3 相对端粒酶活性测定Fig3Relativetelomeraseactivityassay1:7901 一 telo;2:7901-neo;3:7901;4:7901+RNAenzyme.2.6hTERTmRNA 表达检测结果凝胶成像仪对 RTPCR 产物电泳凝胶带进行观测拍照,用分子生物学图像分析系统测定各条目的带及 GAPDH 条带的 v 值(Volume=平均光密
24、度值条带面积),目的带表达强度 Rv=V 目的带/VGAPDH.7901 一 telo 细胞,7901 一 neo 细胞,7901 细胞中 h1EImRNA 相对表达水平分别为(0.560.0l,0.760.02,0.780.03),此结果表明7901 一 telo 细胞 hTERTmRNA 表达较在后两种细胞的表达水平降低,差异显着(P0.05)(见图 4).1O009o050o300l0o图 4 端粒植入对 hTERTmRNA 表达的影响Fig.4EffectoftelomereseedingtohTERTmRNAexpression1:7901;2:7901 一 neo;3:7901-telo;4:100bpDNAMarker-Hmarker.2.7 细胞基因组染色体分析结果核型分析显示 SGC7901 一 telo 细胞染色体数目为 65,66,67,68 条不等,SGC7901 细胞染色体数目为 65,66,67,68 条不等,SGC7901 一 neo 细胞
