1、概论对于各种各样的细胞和病毒基因的可诱导表达，反转录因子是主要的组成部分。因此，在细胞，组织或者动物体重精确监控 NFkB 的活动对于药物发展和信号转导途径的研究是非常重要的。目前为止，这样的研究项目是耗时，枯燥且缺乏高效筛选生产系统。随着 TransAM 专利方法的运用，Active Motif 介绍了第一个以ELISA 为基础的试剂盒来检测并定量转录因子的活动。TransAM 试剂盒是一个快速，使用方便且敏感特异的试验方法。TransAM NFkB 家族试剂盒是专门用来对 NFkB 亚基进行研究的。试剂盒有一个 96 孔板，含有 NFkB 固有序列结合位点的寡核苷酸已经被固定在板上。包含在
2、细胞核或全细胞提取物中的的激活的 NFkB 同源二聚体和异源二聚体特异的结合在寡核苷酸上。通过使用直接与转录因子p65，p50，p52，c-Rel 或者 Rel B 亚基配对的抗体，活化的转录因子亚基结合到寡核苷酸而被检测到。第二抗体与辣根过氧化物酶共轭结合后提供了敏感的显色反应，这可以方便的用分光光度法定量测定。96 孔板实可拆卸的，适合手工使用或高生产筛选的应用。TransAM 转录因子试剂盒是一个方便的方式。简介转录因子牵涉到很多基因的调节，如免疫介质的编码，急性期的调节和炎性反应的调节。DNA 结合蛋白复合物识别一个分散的核苷酸序列（5-GGGACTTTCC-3 ） ，这个序列在不同细
3、胞或病毒反应基因的上游区域。NFkB 由 NFkB 家族成员的同源或异源二聚体复合物组成。在哺乳动物中，NFkB 家族有五个亚基：p50，p65（RelA） ，c-Rel，p52，andRelB。这些蛋白质在氮末端区域有一段长为 300 个氨基酸的保守区域，成为 Rel 同源域，它介导了 DNA 结合，蛋白质二聚化作用和核酸定位。这个区域也是 IkB 抑制因子的目标，这包括IkB，IkB，IkB，Bcl-3，p105 和 p100. 不同 NFkB 亚基二聚体结合有不同的 DNA 结合特异性，并起到了激活特定基因组的作用，像粘附分子，免疫受体和细胞活素类。在 NFkB 信号通路中，p50/p6
4、5 异源二聚体和 p50 同源二聚体是最常见的二聚体。在大多数的细胞中，NFkB 以一种无活性的形式存在在细胞质中，结合在抑制的 IkB 蛋白上。由于不同诱导物对细胞的影响导致磷酸化，泛素化和下面的 IkB 蛋白的降解。P105 的溶蛋白性裂解后产生了两种蛋白质：p50，它有 DNA 结合活性但没有反式激活区域和他的拮抗物，有抑制作用的 IkB.这将导致 NFkB 二聚体的释放，然后转移到细胞核中并激活相应的目标基因。NFkB 能被一系列刺激素激活包括细菌细胞壁的组成部分，像脂多糖或者言行细胞因子如 肿瘤坏死因子和白细胞介素 1。转录因子实验目前，有三种方法广泛的用于测量 NFkB 活性，要么
5、直接检测要么间接检测。1. NFkB 的表达或者细胞质 IkB 的降解可以用 western blot 进行测定，通过针对 NFkB 亚基或者 IkB 使用其提高的抗体。这个方法非常耗时，并不适合进行大量样品的检测。2. NFkB 的结合能力可以通过凝胶阻留发进行测定，也叫做电泳迁移率转变试验(EMSA)。细胞提取物与含有 NFkB 结合共有序列的放射性双链寡核苷酸探针一起培育。如果 NFkB 在细胞提取物中试有活性的，它将结合到探针上。然后样品通过聚丙酰胺凝胶电泳被溶解，接着进行放射性自显影。这个方法是敏感的，但是和原来的过程一样，它是耗时的并且不能应用于高通量筛选。凝胶迁移试验需要非常谨慎
6、，对于处理放射性对于设备有要求。3. 测量 NFkB 活性另外一种方法是基于报告基因，特别是荧光素酶或者 半乳糖苷酶，将其放置于包含 NFkB 共有序列的一个启动子的控制下。这个启动子是人工制造的，用几个 NFkB 顺式元件和 TATA 盒组成，或者是自然形成的，像 HIV 的长末端重复序列。这个过程的限制性：1.报告基因必须重复几次来获得可靠的统计数据 2.报告基因对于可能影响到报告基因表达效果的混杂因素是非常敏感的。因此，试验必须非常标准。这种方法是敏感而且易于大量样品的检测，但是需要报告质粒的高效细胞转染。TransAM NFkBNFkB 在不同免疫过程中是一个重要的因子，表示一个很好的
7、药物靶。然而，在这个领域药物的研究已经被缺乏适用于大量样品的便捷试验所阻滞。为了克服这个缺点，Active Motif 提供了定量测定 NFkB 活性的高通量试验方法。TransAM 试剂盒是以快速适于使用者的 ELISA 的形式，而且对于转录因子是一种敏感特异的试验方法。TransAM NFkB试剂盒包含了一个 96 孔板，板上固定了包含 NFkB 共有序列位点的寡核苷酸。NFkB 的活性形式包含在何种或者全细胞提取物中并特意的结合到这个寡核苷酸上。第一抗体主要用于检测 NFkB 识别在p65,p50,p52,c-Rel 或者 RelB 上的表位，只有当 NFkB 被激活并结合到他的目的 D
8、NA 上时才可以达到。与辣根过氧化物酶共轭结合的第二抗体提供了敏感的显色反应，这很容易通过分光光度法定量检测。一旦细胞提取物准备好，这个试验将在 3.5 小时内完成。由于试验是在 96 孔板中进行的，大量样本可以同时测定，并且允许高通量自动化。这个试验对 NFkB 活动的检测是特异性的，已经显示这种方法比凝胶阻留法快 40 倍，特异性提高 10 倍。在 TransAM 的 3.5小时过程中，我们可以检测出从用 TPA（组织纤溶酶原激活剂）和钙离子载体激活的 Jurkat 细胞 0.5ug 的核酸提取物中的 NFkB 活性。使用 EMSA 的相应试验需要 5ug 的提取物和花费五天时间的放射性自
9、显影。TransAM 在 NFkB 信号通路中有很多的应用，包括药物作用强度，抑制剂或者激活蛋白，并且/或者蛋白质结构/功能。试剂盒的性能和优势检测界限：每孔小于 0.5ug 的核提取物。对于全细胞提取物，可能需要 2 倍投入量。或者，也可以使用每孔小于 0.4ng p50 或 p65 的重组体。TransAM NFkB 比 EMSA 敏感十倍。检测的范围：TransAM 提供了从每孔 0.2-5ug 的核提取物或全细胞提取物，或者从每孔 0.1-40ng p50 或 p65 重组蛋白的定量结果。交叉反应： p65 p50 p52 c-Rel RelB人 + + + + +小鼠 + + + -
10、 +大鼠 + - nt - +试验时间：TransAM 比 EMSA 快 40 倍。试剂盒的组成和储存TransAM NFkB 试剂盒紧为试验使用。不能用作诊断步骤。除了核提取必须保存在-80 度，试剂盒的组成部分保存在-20 度备用。然后，我们建议将每一部分按照下面表格的储存温度存放。如果储存合适，所有组成部分能稳定存放 6 个月。试剂 数量 储存时间NFkB p65，p50 或 c-Rel 抗体 11ul -20 度保存六个月NFkB p52 或 RelB 抗体 11ul 4 度保存六个月抗兔辣根过氧化物酶标记抗体 211ul 4 度保存六个月野型寡核苷酸 AM20 100ul（10pmo
11、l/ul）-20 度保存六个月突变寡核苷酸 AM20 100ul（10pmol/ul）-20 度保存六个月Raji 核提取物 40ul（2.5ug/ul） -80 度保存六个月二硫苏糖醇（DTT） 100ul -20 度保存六个月蛋白酶抑制剂 cocktail 100ul -20 度保存六个月鲱鱼精 DNA 100ul（1ug/ul） -20 度保存六个月裂解缓冲液 AM2 10ml 4 度保存六个月结合缓冲液 AM3 10ml 4 度保存六个月10洗涤液 AM2 60ml 4 度保存六个月10抗体结合缓冲液 AM2 22.2ml 4 度保存六个月延展液 211ml 4 度保存六个月终止液 6
12、0ml 4 度保存六个月96 孔 NFkB 试验板 2 4 度保存六个月板封闭物 2 室温保存额外需要的材料多通道移液器多通道移液储水器摇床核或全细胞提取物450nm 是微孔板分光光度计读取范围。规则说明缓冲液的准备和推荐完全裂解液的准备：我们提供了过量的裂解缓冲液 AM2，目的是实施试验并且准备专门的核提取物。请参照规则说明 Appendix SectionA 准备核提取物。我们的核提取试剂盒也可以分开购买。当准备提取物时，建议使用在 TransAM 试剂盒中的裂解缓冲液 AM2 实施最终裂解步骤。所有下面的稀释也从 TransAM 试剂盒中使用裂解缓冲液 AM2 进行试验。每毫升裂解缓冲液
13、 AM2 中加入 5ul1M DTT 和 10ul 蛋白酶抑制剂cocktail 来制备完全裂解缓冲液的量。一旦稀释，一些蛋白酶抑制剂在几小时后将失活。因此，我们建议在使用之前立即加入蛋白酶抑制剂。如果不当天使用，任何剩余完全裂解缓冲液应当倒掉。完全结合缓冲液的准备：需要每毫升结合缓冲液 AM3 重加入 2ulDTT 和 10ul 的每微升 1 微克的鲱鱼精 DNA 来制备完全结合缓冲液。使用之后，弃剩余的完全结合缓冲液。1漂洗液的制备：如下制备所需要的 1漂洗液：如果需要 100ml 1漂洗液，用90ml 蒸馏水稀释 10ml 10漂洗液。轻轻混匀，避免泡沫。1漂洗液可以在 4 度存储一周。
14、由于 10漂洗液中含有 Tween20 可能形成沉淀块，因此混匀之前必须在 50 度温育 2min 完全重悬沉淀。1抗体结合缓冲液的制备：如下制备所需要的 1抗体结合缓冲液：如果需要 10ml 1抗体结合缓冲液，用 9ml 蒸馏水稀释 1ml 10抗体结合缓冲液。轻轻混匀，避免泡沫。使用之后，弃剩余的 1抗体结合缓冲液。由于 10抗体结合缓冲液 AM2 包含牛血清白蛋白可能形成沉淀，因此使用之前必须在室温下温育并涡旋 1min 完全重悬缓冲液。显影液使用之前，显影液应当在室温下温育。显影液是光敏感性溶液，因此在储存时我们建议避免直接暴露在强光下。随着时间的推移，显影液可能呈现黄色。这并不影响成
15、像。如果显色液呈现蓝色表明它已污染必须丢弃。 。使用之前，将显色液置于室温下至少一个小时。在平均分配显色液入孔时，将适于试验的显影液的量转移到第二容器中。使用之后，丢弃剩余的显影液。终止液使用之前，将适于试验的终止液的量转移到第二容器中。使用之后，丢弃剩余的终止液。注意：终止液是腐蚀性溶液。当使用它时，穿戴好个人保护装备，如安全眼镜，手套和白大褂。核提取对 NFkB 活性 Raji 核提取物作为阳性对照被提供。当使用每孔 5ug是提取物最好并提供强烈的信号。我们建议以 5ul 来平均分配提取物，并在-80 度保存。避免反复冻融。不同的细胞提取物从 Active Motif 中获得。野型和突变型
16、共有序列核苷酸野型共有序列核苷酸作为 NFkB 结合的竞争者来检测实验的特异性。竞争试验将确认蛋白质亚基结合到板上对于 NFkB 共有序列结合片段是特异的。每孔使用 20pmol，寡核苷酸将阻止 NFkB 结合到固定于板上的探针。相反的，突变共有序列核苷酸对于 NFkB 的结合没有影响。每孔加入 2ul 适量的寡核苷酸到 31.8ul 的完全结合缓冲液中来制备所需要的野型或突变型共有序列核苷酸。为了优化竞争，先向孔中加入寡核苷酸，然后加入细胞提取物。在加入细胞提取物之前，并不一定进行寡核苷酸的温育步骤。寡核苷酸的竞争只需要作为对照进行试验。建议内一种新细胞型的使用都检测寡核苷酸的竞争。可选试验
17、标准曲线的绘制对于在他们样本中想要定量检测 NFkB 的人，Active Motif 提供了NFkBp50 和 p65 重组体作为蛋白质标准的使用。每一种蛋白提供了很多特异的分析证明书。准备标准曲线之前请参阅它们因为蛋白质浓度变化很大。1. 以 100ng/ul 重组蛋白的工作储存浓度开始。使用以下浓度制定标准曲线一式两份：0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0.008 和 0ng/ul.注意：上述范围作为一种指导，更有价值更广泛的范围将被使用。详情请参照多种蛋白质的特异数据表。2. 将 1ul 的 100ng/ul 工作储存量加入到 199ul 完全裂解缓
18、冲液中，制成 0.5ng/ul 的溶液。接着，吸取 60ul 的完全裂解缓冲液到 7个离心管中。使用 0.5ng/ul 的溶液按照下图进行倍比稀释。在每次转移之前将离心管充分的混匀。0.5ng/ul 的标准是一个很高的标准，并且裂解缓冲液是 0ng/ul.3. 按照规则说明步骤一的第二条，从每个离心管中的 20ul 将等分到孔中，并将相应的得到以下 NFkB 的数量值：每孔10,5,2.5,1.25,0.625,0.312,0.156 和 0ngNFkB 反转录因子实验确定微孔条的适当数量需要对样本，对照和空白进行一式两份的测试。当你进行实验时，如果需要使用少于每条八个孔，你应当用部分板封闭液
19、保护膜覆盖不用的孔。如果保持干燥，孔内容物在室温下是稳定的，因此，以后可以用作另外的实验。将不用的孔条放于 4 度铝袋中保存。使用孔支持物用于实验。准备完全裂解缓冲液，完全结合缓冲液，1洗液和 1抗体结合缓冲液如上缓冲液准备和推荐部分所述。多头移液器储液槽用于分配完全结合缓冲液，洗液，抗体结合缓冲液，延展液和终止液进入孔中使用。步骤一：NFkB 结合其共有序列1. 加 30ul 完全结合缓冲液到每一个孔中。如果你想进行竞争结合实验，加 30ul 含有 2ul 的野型或突变核苷酸的完全结合缓冲。2. 样品孔：每孔加 20ul 用完全裂解缓冲液稀释的样品。我们建议每孔使用 2-20ug 的核酸提取
20、物在稀释完全裂解缓冲液中。在 13 页提供了核酸提取的规范。如果是全细胞提取我们建议每孔使用 4-40ug。阳性对照孔：每孔加含 5ug 提供的 Raji 核酸提取物的完全裂解缓冲液 20ul（每孔 2ul 的核酸提取物在 18ul完全裂解缓冲液中） 。空白孔：每孔只加 20ul 完全裂解缓冲液。可选p50 和 p65 蛋白质标准孔：每一个孔加 20ul适量的蛋白质标准稀释完全裂解缓冲液（细节在第八页） 。3. 使用提供的粘附覆盖物封闭板。室温温育 1 小时并轻柔搅动。为了保护未使用的孔用于以后的实验，在以下的步骤中使其继续覆盖。在条孔板中未使用的条带放于铝箔袋中，用胶带封闭并储存于 4。4.
21、 每个孔用 1洗液 200ul 洗涤三次。每次洗，轻轻震荡板并将板中的洗液倒空，接着在吸水纸中轻拍倒置的板三次。步骤二：一抗的结合1. 加 100ul 已经稀释的一种 NFkB 抗体到每一个孔中，包括空白孔。2. 盖上板在室温静置温育 1 小时。3. 用 1洗液 200ul 洗孔三次。 （如步骤一的第四条）步骤三：二抗的结合1. 加入 100ul 已稀释过的辣根过氧化物酶标记的抗体到孔中。2. 盖上板在室温静置温育 1 小时。3. 温育过程中，将显色液放在室温。4. 用 1洗液 200ul 洗孔四次。 （如步骤一的第四条）步骤四：比色反应1. 加 100ul 显色液到所用孔中。2. 室温温育
22、30 秒到 5 分钟，避光。请阅读本试剂盒提供的特异性且有最佳作用时间试剂盒套件的分析说明书。观察样本孔中蓝色的变化，直到介质变为深蓝色。不要作用过长时间。注意：重组标准品显示很快。3. 加 100ul 终止液。在酸的作用下，蓝色变为黄色。4. 5min 中内在分光光度计上读取 450 纳米的吸收值，并以 655纳米波长时为最佳参考。板的空白值应根据生产制造商的指示使用空白孔。可选择的实验使用标准曲线进行结果计算如果你使用 Active Motif 的 NFkBp50 或 p65 蛋白的重组体已经制成了一个标准曲线，每个重复标准品，对照和样本的平均读数减去从零获得的吸光度值。在坐标上标出标准量的 OD 值并绘制标准曲线图。数据可以通过对数坐标纸能够线性化并且也可以应用回归分析。为了确定 NFkB 在样本中的数量，找到在 y 轴的样品吸光度值并且水平延伸至标准曲线，再从交叉点垂直延伸到 x 轴并且读取相应的标准数值即可。注意：如果样本已经被稀释，从标准曲线读取的数值必须乘以稀释倍数。
