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1、实验室常用技术参数资料实验室常用技术参数资料一、核酸及蛋白质常用数据1核苷三磷酸的物理常数化合物 分子量 max(pH7.0)1摩尔溶液（pH7.0）中 max时的最大吸收值 OD280/OD260ATP 507 259 15400 0.15CTP 483 271 9000 0.97GTP 523 253 13700 0.66UTP 484 262 10000 0.38dATP 494 259 15200 0.15dCTP 467 271 9300 0.98dGTP 507 253 13700 0.66dTTP 482 267 9600 0.712常用核酸的长度与分子量核酸 核苷酸数 分子量D

2、NA 48502（双链环状） 3.0107pBR322 4363（双链） 2.810628SrRNA 4800 1.610623SrRNA 3700 1.210618SrRNA 1900 6.110519SrRNA 1700 5.51055SrRNA 120 3.6104tRNA（大肠杆菌） 75 2.51043常用核酸蛋白换算数据（1）重量换算1g=10-6g 1pg=10-12g1ng=10-9g 1fg=10-15g（2）分光光度换算：1A260 双链 DNA=50g/ml1A260 单链 DNA=30g/ml1A260 单链 RNA=40g/ml（3）DNA 摩尔换算：1g 100bp

3、 DNA=1.52pmol=3.03pmol 末端1g pBR322 DNA=0.36pmol1pmol 1000bp DNA=0.66g1pmol pBR322=2.8g1kb 双链 DNA（钠盐）=6.6105 道尔顿1kb 单链 DNA（钠盐）=3.3105 道尔顿1kb 单链 RNA（钠盐）=3.4105 道尔顿（4）蛋白摩尔换算：100pmol 分子量 100，000 蛋白质=10g100pmol 分子量 50，000 蛋白质=5g100pmol 分子量 10，000 蛋白质=1g氨基酸的平均分子量=126.7 道尔顿（5）蛋白质/DNA 换算：1kb DNA=333 个氨基酸编码容

4、量 =3.7104MW 蛋白质10，000MW 蛋白质=270bp DNA30，000MW 蛋白质=810bp DNA50，000MW 蛋白质=1.35kb100，000MW 蛋白质=2.7kb DNA4常用蛋白质分子量标准参照物（1）高分子量标准参照 （2）中分子量标准参照 （3）低分子量标准参照肌球蛋白 分子量 磷酸化酶 B 97，400 碳酸酐酶 31，00肌球蛋白 212，000 牛血清白蛋白 66，200 大豆脻蛋白酶 21，500-半乳糖甘酶 B 116，000 谷氨酶脱氢酶 55，000 抑制剂 磷酸化酶 B 97，400 卵白蛋白 42，700 马心肌球蛋白 16，900牛血清

5、白蛋白 66，200 醛缩酶 40，000 溶菌酶 14，400过氧化氢酶 57，000 碳酸酐酶 31，000 肌球蛋白（F1 ） 8，100醛缩酶 40，000 大豆脻蛋白酶 21，500 肌球蛋白（F2 ） 6，200抑制剂 肌球蛋白（F3） 2，500溶菌酶 14，400 5常用 DNA 分子量标准参照物DNA/Hind DNA/EcoR /Hind +EcoR pBR322/Hae23130 21226 21227 587 1239416 7421 5148 405 1046557 5804 4973 504 894361 5643 4268 458 802322 4843 3530

6、 434 642027 3530 2027 267 57564 1904 234 51125 1584 213 211375 192 18974 184 11831 124 7564 125 续上表pBR322/Hinf 174/Hinf 174/Hae 174/Tap1631 726 140 1353 2914517 713 118 1078 1175506 553 100 872 404396 500 82 603 327344 417 66 310 231298 413 48 281 141221 311 42 271 87220 249 40 234 54154 200 24 194

7、3375 151 118 2072 二、常用缓冲液1分子克隆常用缓冲液2磷酸缓冲液（1）25下 0.1mol/L 磷酸钾缓冲液的配制 pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml)5.8 8.5 91.56.0 13.2 86.86.2 19.2 80.86.4 27.8 72.26.6 38.1 61.96.8 49.7 50.37.0 61.5 38.57.2 71.7 28.37.4 80.2 19.87.6 86.6 13.47.8 90.8 9.28.0 94.0 6.2（2）25下 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液的配制 pH 1mol/L Na2HPO

8、4(ml) 1mol/L NaH2PO4(ml)5.8 7.9 92.16.0 12.0 88.06.2 17.8 82.26.4 25.5 74.56.6 35.2 64.86.8 46.3 53.77.0 57.7 42.37.2 68.4 31.67.4 77.4 22.67.6 84.5 15.57.8 89.6 10.48.0 93.2 6.8:用蒸馏水将混合的两种 1mol/L 贮存液稀释至 1000ml，根据 Henderson-Hasselbalch 方程计算其 pH 值：pH=pK+1g(质子受体/质子供体)在此，pK=6.86(25) 。3电泳缓冲液测序凝胶加样缓冲液98%

9、去离子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青 FF0.025%溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与 Dowex XG8 混合床树脂共同搅拌 1 小时进行去离子处理，并用 Whatman 1 号滤纸过滤 2 次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于 -70。常用的电泳缓冲液缓冲液 使用液 浓贮存液（每升）Tris-乙酸（ TAE） 1：0.04mol/L Tris- 乙酸 50：242g Tris 碱0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDT

10、A(pH8.0)Tris-磷酸（ TPE） 1:0.09mol/L Tris-磷酸 10:10g Tris 碱0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（ TBE）a 0.50.045mol/L Tris-硼酸 5：54g Tris 碱0.001mol/L EDTA 27.5 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液 b 1:50mmol/L NaOH 1:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-

11、甘氨酸 c 1:25mmol/L Tris 5:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级） （pH8.3）0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级)说明：TBE 溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存 5溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以 1TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但 0.5的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以 1：10 稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1TBE 以提供足够的缓冲容量。碱性

12、电泳缓冲液应现用现配。Tris- 甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。2SDS 凝胶加样缓冲液：100mmol/L TrisHCl(6.8)200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT ）4%SDS（电泳级）0.2%溴酚蓝20%甘油不含 DTT 的 2SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取 1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。4凝胶加样缓冲液缓冲液类型 6缓冲液 贮存温度 0.25%溴酚蓝 40.25%二甲苯青 FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 0.25 溴酚蓝 室温0.25%二甲苯青 FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) 0.25%溴酚蓝 40.25%二甲苯青 FF 30

13、%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 440%(W/V)蔗糖水溶液 碱性加样缓冲液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA 18%聚蔗糖(Ficoll400) 40.15%溴甲酚绿 0.25%二甲苯青 FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关。以 0.5TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青FF 的泳动则与长 4

14、kb 的双链线状 DNA 相同。在琼脂糖浓度为 0.5%1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。5各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制 所需 pH 值（25） 0.1mol/L HCl 的体积71 45772 44773 43474 42075 40376 38577 36678 34579 32080 2928.1 26.28.2 22.98.3 19.98.4 17.28.5 14.78.6 12.4

15、8.7 10.38.8 8.58.9 7.0某一特定 pH 值的 0.05mol/L Tris 缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris 碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的 0.1ml/L HCl 混合，加水将体积调至 100ml（2）温度对 50mmol/L TrisHCl 液 pH 值的影响4 25 3781 7 5 7282 7 6 7383 7 7 7484 7 8 7585 7 9 7686 8 0 7787 8 1 7888 8 2 7989 8 3 8090 8 4 8191 8 5 8292 8 6 8393 8 7 8494 8 8 85（6）常用缓冲液的

16、 pKa 值缓冲液 分子量 pKa 值 缓冲范围Trisa 12.1 8.08 7.17.9HEPESb 283.3 7.47 7.28.2MPOSc 209.3 7.15 6.67.8PIPESd 304.3 6.76 6.27.3MESe 195.2 6.09 5.46.8a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磷酸； c：3-（N- 吗啉代）丙磺酸；d：N，N-双（2- 乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。7温度对常用缓冲液 pH 的影响缓冲体系 pKa(20) pKa/10Mes 6.15 -0.110Ada 6.60 -0.110PiPes 6.80 -0.0

17、85Aces 6.90 -0.200Bes 7.15 -0.160Mops 7.20 -0.013Tes 7.50 -0.200Hepes 7.55 -0.014Tricine 8.15 -0.210Tris 8.30 -0.310Bicine 8.35 -0.180Glycylglycine 8.40 -0.280三、常用酶的配制1溶菌酶用水配制成 50mg/ml 的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20。每一小份一经使用后便予丢弃。2蛋白水解酶类贮存液 贮存温度 反应浓度 反应缓冲液 温度 预处理0.01mol/L Tris(pH7.8) 链霉蛋白酶 a 20mg/ml -20（溶于水） 1

18、mg/ml 0.01mol/L EDTA 37 自消化 b0.5% SDS 0.01mol/L Tris(pH7.8) 蛋白酶 Kc 20mg/ml -20（溶于水） 50g/ml 0.005mol/L EDTA 3756 无须预处理0.5% SDS a：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b：自消化可消除 DNA 酶和 RNA 酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于 10mmol./l TrisHCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl 中，配成 20mg/ml 浓度，于 37温育 1h。

19、经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20。c：蛋白酶 K 是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（ Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个 Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去 Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失 80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶 K 消化过程中通常加入 EDTA（以抑制依赖于 Mg2+的核酸酶的作用） 。但是，如果要消化对蛋白酶 K 具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有 1mm

20、ol/l Ca2+而不含 EDTA 的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入 EGT（pH8.0 ）至终浓度为 2mmol/L,以鳌合 Ca2+。3无 DNA 酶的 RNA 酶将胰 RNA 酶（RNA 酶 A）溶于 10mmol/l TrisHCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl 中，配成10mg/ml 的浓度，于 100加热 15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。四、常用抗生素溶液抗生素 贮存液 a 工作浓度浓度 保存条件 严紧型质粒 松弛型质粒氨苄青霉素 50mg/ml(溶于水) -20 20g/ml 60g/ml羧苄青霉素 50mg/ml(溶于水) -20 20g

21、/ml 60g/ml氯霉素 34mg/ml(溶于乙醇) -20 25g/ml 170g/ml卡那霉素 10mg/ml(溶于水) -20 10g/ml 50g/ml链霉素 10mg/ml(溶于水) -20 10g/ml 50g/ml四环素 b 5mg/ml(溶于乙醇) -20 10g/ml 50g/mla：以水为溶剂的抗生素贮存液通过 0.22m滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如 LB 培养基） 。五、常用贮存液的配制130% 丙烯酰胺溶液【配制方法】将 29g 丙烯

22、酰胺和 1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中。加热至 37溶解之，补加水至终体积为 100ml。用 Nalgene 滤器（0.45m 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH 值应不大于 7.0，置棕色瓶中保存于室温。【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约 0.2 体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt） ，搅拌过夜，然后用 Whatma

23、n 1 号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。240% 丙烯酰胺【配制方法】把 380g 丙烯酰胺（DNA 测序级）和 20g N，N- 亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 600ml 的蒸馏水中。继续按上述配制 30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为 1L。【注意】见上述配制 30%丙烯酰胺的说明， 40%丙烯酰胺溶液用于 DNA 序列测定。3放线菌素 D 溶液【配制方法】把 20mg 放线菌素 D 溶解于 4ml 100%乙醇中，1：10 稀释贮存液，用 100%乙醇作空白对照读取 OD440 值。放线菌素 D（分子量为 12

24、55）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而 1mg/ml 的放线菌素 D 溶液在 440nm 处的吸光值为 0.182，放线菌素 D 的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20。【注意】放线菌素 D 是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素 D 制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm 波长处的光吸收确定放线菌素 D 的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。40.1mol/L 腺苷三磷酸（ ATP）溶液【配制方法】在 0.8ml 水中溶解 60mg

25、ATP,用 0.1mol/L NaOH 调至 pH 值至 7.0，用蒸馏水定容 1ml，分装成小份保存于-70510mol/L 乙酸酰溶液【配制方法】把 770g 乙酸酰溶解于 800ml 水中，加水定容至 1L 后过滤除菌。610% 过硫酸铵溶液【配制方法】把 1g 过硫酸铵溶解于终量为 10ml 的水溶液中，该溶液可在 4保存数周。7BCIP 溶液【配制方法】把 0.5g 的 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于 10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于 482BES 缓冲盐溶液【配制方法】用总体积 90ml 的蒸馏水溶解 1.07g 盐溶液 BESN，N-双（2- 羟乙

26、基）-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl 和 0.027g Na2HPO4，室温下用 HCl 调节 该溶液的 pH 值至 6.96、然后加入蒸馏水定容至 100ml，用 0.22m滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20。91mol/L CaCl2 溶液【配制方法】在 200ml 蒸馏水中溶解 54g CaCl26H2O，用 0.22m滤器过滤除菌，分装成 10ml 小份贮存于-20。【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至 100ml，用 Nalgene 滤器（0.45m孔径）过滤除菌，然后骤冷至 0。102.5mol/L CaCl2 溶液【配制方法】在 20ml 蒸馏水中溶解

27、 13.5g CaCl26H2O，用 0.22m滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于-20。111mol/L 二硫苏糖醇（DTT）溶液【配制方法】用 20ml 0.01mol/L 乙酸钠溶液（ pH5.2）溶解 3.09g DTT，过滤除菌后分装成 1ml 小份贮存于-20。【注意】DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。12脱氧核苷三磷酸（dNTP ）溶液【配制方法】把每一种 dNTP 溶解于水至浓度各为 100mmol/L 左右，用微量移液器吸取 0.05mol/l Tris碱分别调节 每一 dNTP 溶液的 pH 值 7.0（用 pH 试纸检测） ，把中和后的每种 dNTP

28、溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种 dNTP 的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为 50mmol/L 的 dNTP，分装成小份贮存于-70。碱基 波长（nm） 消化系数（）L/（molcm）A 259 1.54104G 253 1.37104C 271 9.10103T 260 7.40103比色杯光径为 1cm 时,吸光度=M130.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H2O） ，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节 溶液的 pH 值至 8.0（约需 20g NaO

29、H 颗粒）然后定容至 1L，分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA 二钠盐需加入 NaOH 将溶液的 pH 值调至接近 8.0，才能完全溶解。14溴化乙锭（10mg/ml 溶液）【配制方法】在 100ml 水中加入 1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。【注意】小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。152HEPES 缓冲盐溶液【配制方法】用总量为 90ml 的蒸馏水溶解 1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO42H2O、0.2g 葡聚糖和 1gHEPES

30、，用 0.5mol/l NaOH 调节 pH 值至 7.05，再用蒸馏水定容至 100ml。用 0.22m滤器过滤除菌，分装成 5ml 小份，贮存于-20。16IPTG 溶液【配制方法】IPTG 为异丙基硫代 -D-半乳糖苷（分子量为 238.3） ，在 8ml 蒸馏水中溶解 2g IPTG 后，用蒸馏水定容至 10ml，用 0.22m滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于-20。171mol/L 乙酸镁溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 214.46g 四水乙酸镁，用水定容至 1L 过滤除菌。181mol/L MgCl2 溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 203.4g MgC

31、l26H2O，用水定容至 1L，分装成小份并高压灭菌备用。【注意】MgCl2 极易潮解，应选购小瓶（如 100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。19-巯基乙醇（BME）溶液【配制方法】一般得到的是 14.4mol/L 溶液，应装在棕色瓶中保存于 4。【注意】BME 或含有 BME 的溶液不能高压处理。20NBT 溶液【配制方法】把 0.5g 氯化氮蓝四唑溶解于 10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于 4。21酚/ 氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用 0.1mol/L TrisHCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的 0.01mol/l TrisH

32、Cl(pH7.6)液层，保存于 4。【注意】酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。2210mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液【配制方法】用异丙醇溶解 PMSF 成 1.74mg/ml（10mmol/L） ，分装成小份贮存于-20。如有必要可配成浓度高达 17.4mg/ml 的贮存液（100mmol/L ） 。【注意】PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被 PMSF

33、 污染的衣物应予丢弃。PMSF 在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF 在水溶液中的活性丧失速率随 pH 值的升高而加快，且 25的失活速率高于 4。pH 值为 8.0 时，20mmol/l PMSF 水溶液的半寿期大约为 85min，这表明将 PMSF 溶液调节 为碱性（pH8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。23磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液【配制方法】在 800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2PO4,用 HCl 调节 溶液的 pH 值至 7.4 加水定容至 1L，在 15lb

34、f/in2(1034105Pa)高压下蒸气灭菌 20min。保存于室温。241mol/L 乙酸钾（pH7.5）溶液【配制方法】将 9.82g 乙酸钾溶解于 90ml 纯水中，用 2mol/L 乙酸调节 pH 值至 7.5 后加入纯水定容到 1L，保存于 -20。25乙酸钾溶液（用于碱裂解）【配制方法】在 60ml 5mol/L 乙酸钾溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水，即成钾浓度为 3mol/L 而乙酸根浓度为 5mol/L 的溶液。263mol/L 乙酸钠（pH5.2 和 pH7.0）溶液【配制方法】在 80ml 水中溶解 408.1g 三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH 值至

35、 5.2 或用稀乙酸调节 pH值至 7.0，加水定容到 1L，分装后高压灭菌。275mol/L NaCl 溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 292.2g NaCl 加水定容至 1L，分装后高压灭菌。2810% 十二烷基硫酸钠（SDS ）溶液【配制方法】在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS，加热至 68助溶，加入几滴浓盐酸调节 溶液的pH 值至 7.2，加水定容至 1L，分装备用。【注意】SDS 的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的 SDS，10%SDS 溶液无须灭菌。2920SSC 溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 17

36、5.3g NaCl 和 88.2g 柠檬酸钠，加入数滴 10mol/l NaOH 溶液调节 pH 值至 7.0，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。3020SSPE 溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 17.5g NaCl、27.6g NaH2PO4H2O 和 7.4g EDTA，用 NaOH 溶液调节 pH 值至 7.4（约需 6.5ml 10ml/L NaOH） ，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。31100%三氯乙酸溶液【配制方法】在装有 500g TCA 的瓶中加入 227ml 水，形成的溶液含有 100%（M/V）TCA 。321mol/L Tris 溶液【配制方法】在 800m

37、l 水中溶解 121.91g Tris 碱，加入浓 HCl 调节 pH 值至所需值。pH HCl7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH 值，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。【注意】如 1mol/L 溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的 Tris。尽管多种类型的电极均不能准确测量 Tris 溶液的 pH 值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。Tris 溶液的 pH 值因温度而异，温度每升高 1，pH 值大约降低 0.03 个单位。例如：0.05mol/L 的溶液在 5、25、和 37时的 pH 值分别为 9.5、8.9 和 8.6。33Tris

38、缓冲盐溶液（TBS） （25mmol/l Tris ）【配制方法】在 800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl 和 3g Tris 碱，加入 0.015g 酚并用 HCl 调至 pH值至 7.4，用蒸馏水定容至 1L，分装后在 151bf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌 20min，于室温保存。34X-gal 溶液【配制方法】X-gal 为 5-溴-4-氯-3-吲哚 -D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解 X-gal 配制成的 20mg/ml 的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有 X-gal 溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20。X-gal

39、 溶液无须过滤除菌。杂交试验中用于降低背景的封闭剂试剂 用途Denhardt 试剂 Northern 杂交使用 RNA 探针的杂交单拷贝序列的 Southern 杂交将 DNA 固定于尼龙膜上的杂交Denhardt 试剂通常配制 50贮存液，过滤后保存于-20 。可将该贮存液 10 倍稀释于预杂交液（常为含有 0.5%SDS 和 100g/ml经变性被打断的鲑精 DNA 的 6SSC 或 6SSPE）中。50Denhardt 液中含 5g 聚蔗糖（ Ficoll,400 型，Pharmacia） 、5g 聚乙烯吡咯烷酮和 5g 牛血清白蛋白（组分 V”Sigmal） ，加水至终体积为 500m

40、l。BLOTTO Grunstein-Hogness 杂交Benton-Davis 杂交除单拷贝序列 Southern 杂交以外的所有 Southern 杂交斑点印迹1BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含 5%胶脂奶粉和 0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于 4。使用前可用预杂交液稀释 25 倍。BLOTTO 不应与高浓度的 SDS 并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入 NP-40 至终浓度为 1%。BLOTTO 不能用作 Northern 杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中

41、可能含有 RNA 酶，其活性之高使人无法接受。注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。肝素 Southern 杂交原位杂交肝素（Sigma H-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用 4SSPE 或 4SSC 溶解配制成 50mg/ml 的浓度，保存于 4。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为 500g/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为 50g/ml。经变性并被打断的鲑精 DNA southern 和 Northern 杂交把鲑鱼精子 DNA（Sigma,盐钠）溶解于水配制成 10mg/ml 的浓度，必要时于室温磁力搅拌24h

42、 助溶。把溶液中 NaCl 的浓度调至 0.1mol/L，并用酚和酚 /氯仿各抽提一次，回收水相。合 DNA 溶液快速通 17 号皮下注射针头 12 次，以剪切 DNA。加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇沉淀 DNA。离心回收 DNA 并重溶于水，配制成 10mg/ml 的浓度，测定溶液的 OD260 值并计算出精确的 DNA 浓度，然后煮沸 10min，分装成小份保存于-20。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有 100g/ml经变性并被打断的鲑鱼精子 DNA六、常用凝胶的技术参数1葡聚糖凝胶的某些技术数据种类 干颗粒直径（） 分子量分级范围 床体积毫升/克干分子

43、筛 得水值 溶胀最少平衡时间（h） 柱头压力（ kPa）(2.5cm 直径柱)肽及球形蛋白质 葡聚糖（线性分子） 室温 沸水浴 Sephadex G-10 40 120 700 700 2 3 1.00.1 3 1 Sephadex G-10 40 120 1500 1500 2.53.5 1.53.5 3 1 Sephadex G-25 粗级 100300 (5 100 目) 中级 50150 (100 200 目) 1,0005,000 1005,000 46 1.50.2 6 2 细级 20800(200 400 目 ) 超细 1040 Sephadex G-50 粗级 100200 中

44、级 50150 1,500 500 细级 2080 30,000 10,000 911 5.00.3 6 2 超细 1040 Sephadex G-75 40120 3,000 1,000 超细 1040 70,000 950,000 1215 7.50.5 24 3 3.92 15.86Sephadex G-100 40120 4,000 1,000 超细 1040 1,500,000 150,000 1520 10.01.0 48 5 2.359.41Sephadex G-150 40120 5,000 1,000 2030 超细 1040 400,000 150,000 1822 15.

45、01.5 72 5 0.88 3.53Sephadex G-200 40120 5000 1000 3040 1040 800,000 200,000 2025 20.02.0 72 5 0.39 1.572.聚丙烯酰胺凝胶的技术数据型号 排阻的下限(分子量) 分级分离范围(分子量) 膨胀后的床体积(ml/g 干凝胶) 膨胀所需最少时间(室温,h)Bio-gel-P-2 1,600 2002,000 3.8 24Bio-gel-P-4 3,600 5004,000 5.8 24Bio-gel-P-6 4,600 1,0005,000 8.8 24Bio-gel-P-10 10,000 5,00

46、017,000 12.4 24Bio-gel-P-30 30,000 20,000 50,000 14.9 1012Bio-gel-P-60 60,000 30,000 70,000 19.0 1012Bio-gel-P-100 100,000 40,000100,000 19.0 24Bio-gel-P-150 150,000 50,000150,000 24.0 24Bio-gel-P-200 200,000 80,000200,000 34.0 48Bio-gel-P-300 300,000 100400,000 40.0 483琼脂糖凝胶的技术数据型号 琼脂糖含量%（W/W） 排阻的下

47、限（分子量） 分级分离的范围（分子量） 生产厂家Sepharose 4B 4 0.31063106 PharmaciaSepharose 2B 2 210625106 Sagavac 10 10 2.5105 11042.5105 SeravacSagavac 8 8 7105 2.51047105 Sagavac 6 6 2106 51042106 Sagavac 4 4 15106 210515106 Sagavac 2 2 150106 510515107 Bio-gel A-0.5M 10 0.5106 11040.5106 Bio-RadBio-gel A-1.5M 8 1.5106

48、 11041.5106 Bio-gel A-5M 6 5106 11045106 Bio-gel A-15M 4 15106 410415106 Bio-gel A-50M 2 50106 110550106 Bio-gel A-150M 1 150106 1106150106 4各处凝胶所允许的最大操作压凝胶 最大静水压（kPa）Sephadex G-10 9.8G-15 9.8G-25 9.8G-50 9.8G-75 4.95琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA 分辨范围凝胶浓度（%） 线性 DNA 长度（bp ）0.5 1000300000.7 800120001.0 500100001.2 40070001.5 20