1、 畜牧学课程作业题目：动物转基因技术理论及其研究进展学 院：农学院 专业年级：种子科学与工程 2011 级学 号： 学生姓名： 动物转基因技术理论及其研究进展摘要：动物转基因技术是 21 世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，它是指通过基因工程技术将外源基因整合到受体动物基因组中，从而使其得以表达和遗传的生物技术。动物转基因的关键限制因素是转基因效率和基因表达的精确调控。目前有多种转基因技术，每一种技术各有其优缺点，仍然需要进一步研究。随着研究的深入，转基因技术必将在探讨基因功能、动物遗传改良、生物反应器、动物疾病模型、器官移植等领域有广阔的应用前景。文章综述了近年发展的提高转基因效率的生殖干细
2、胞法、提高转基因精确性的基因打靶法、RNA 干扰(RNAi)介导的基因沉默技术和诱导多能干细胞(iPS)转基因技术。新的转基因技术为转基因动物的研究提供了更好的平台，可以加快促进人类医药卫生、畜牧生产等领域的发展。关键词：转基因技术；基因打靶；RNA 干扰；iPS 细胞动物转基因技术是在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和 DNA 重组技术的基础上，运用基因丁程等实验技术手段，将分离得到的外源目的基因或重组基因导人动物受精卯或早期胚胎细胞中，使之整合到宿主细胞基因组内，随细胞的分裂而增殖，并稳定地遗传给下一代的一种生物技术。转基因技术开始于 20 世纪 80 年代，Jaenisch 等首次应用
3、反转录病毒感染胚胎，制备了转基因动物。随着新技术新方法的出现，动物转基因技术也在不断的完善之中。利用传统的转基因方法，如显微注射法、精子载体法、电穿孔法、脂质体介导法等，已经制备了转基因小鼠、大鼠、猪、牛、羊、鸡等多种转基因动物。经过 20 多年的发展，动物转基因技术在其多样性和实用性方面均取得了显著的进步，尤其是近几年发展的几项新技术，使转基因动物的研究产生了历史性的飞跃。通过生殖干细胞介导的转基因技术、对胚胎干细胞以及体细胞等进行基因打靶的定点整合转基因技术、RNA 干扰介导的基因沉默技术以及诱导多能干细胞(iPS)技术，提高了转基因动物制备效率，使基因表达的精确调控成为现实。更多更新颖的
4、动物转基因技术的出现，使得转基因动物具有更加广阔的应用前景，如制备动物生物反应器、提高畜禽生产能力及肉奶品质、培育抗病动物、生产人类用动物器官、建立人类疾病模型等，将给人类带来巨大的经济效益。一、生殖干细胞法1.1 精原干细胞法精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是在哺乳动物的睾丸内一群像胚胎干细胞(Embryostem cellsES cells)一样具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞。精原干细胞位于雄性动物体内曲细精管生精上皮基膜内，不仅能够自我更新生成新的干细胞，而且可以源源不断的增殖分化形成各阶段的生殖细胞直至精子，从而向下一代传递遗传信息。精原
5、干细胞移植技术是近年发展起来的一项新的动物繁殖技术，该技术是将体外培养的适龄雄性供体动物的精原干细胞注入适龄受体动物的生精小管中，进而产生精子。此项技术为研究精子的发生以及转基因动物的制作提供了一个极佳的思路，因为在体外培养精原干细胞的过程中可以探索最佳的 DNA 转染条件，还能够对转染外源基因的阳性精原干细胞进行筛选，从而大大提高了转基因效率。利用精原干细胞进行转基因已成为目前转基因动物研究领域的热点之一。1994 年，Brinster 等首先建立了该技术，并实现了供体小鼠的精原干细胞在受体中进行精子发生和单倍体的生殖遗传。在应用该技术过程中的异种移植法更是富有挑战性的创新。Nagano 等
6、在体外用反转录病毒对小鼠精原干细胞进行转染，转染效率为 220。将转染后的精原干细胞移植入受体小鼠睾丸中，结果在子代中发现 45的子代小鼠为稳定的转基因小鼠，并表达外源基因，提示外源基因已被稳定整合入干细胞基因组。KanatsuShinohara 等尝试将携带有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的慢病毒载体与体外培养的大鼠精原干细胞混合，然后将其移植到免疫缺陷的小鼠睾丸中，观察发现大鼠精原干细胞在小鼠睾丸内产生了表达 EGFP 的生精细胞，并生成精子，最终生产出转基因大鼠。Honaramooz 等通过腺相关病毒(Denoassociatedvirus，AAv)携带 GFP 报告基因转染体外培养
7、的山羊精原干细胞，然后将其移植到射线照射处理过的受体山羊睾丸内，转染后的精原干细胞能够定植并生成精子。采精后进行体外受精，转基因胚胎阳性率可达 10。这是第一个成功通过精原干细胞移植的方法进行大家畜转基因研究的报道，为建立转基因大动物模型带来了希望。随着培养体系的不断完善，筛选、移植方法的不断改进，一定可以获得更高的移植成功率，提高生产转基因动物的效率等。1.2 原始生殖细胞法原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是指能够发育成为精子或卵子的祖先细胞，来源于胚胎生殖嵴，与来源于囊胚内细胞团(Inner cell mass)的胚胎干细胞同属全胚层多能干细胞(Plur
8、ipotentstem cells)。原始生殖细胞可以定居在受体性腺，并能够在受体胚胎性腺迁移、增殖。又由于各个时期的原始生殖细胞都可以作为转基因的受体细胞，故以其作为载体进行转基因研究较为简便、高效，并逐渐引起关注。Natio 等从早期鸡胚血液分离得到了 PGCs，利用脂质体法导人 LacZ 基因，然后注入受体胚，53 只鸡胚发育到第 3 d 且在生殖嵴表达了 LacZ 基因。2006年，Van de Lavoir 等将携带有绿色荧光蛋白基因的 PGC 注入孵化 3 d 的鸡胚内，将孵化出的公鸡与未转入基因的母鸡交配，成功获得生殖腺转入外源基因并带有绿色荧光的雏鸡。而对于哺乳动物，Brins
9、ter 等则证明了可以通过雄性个体之间的精原细胞转移来制备转基因动物，他们向 C57BL6STL 杂交一代小鼠的曲精细管内注入 ZFlacZ 系小鼠的 PGC，结果证明植入的 PGC 成功发育为精子细胞，并能够受精产生后代。另外，Mueller 等的报道中指出从转基因猪分离出的 PGC 具有一定的嵌合能力，从而证实了利用 PGC 进行猪或其它大动物转基因的可行性。利用原始生殖细胞进行转基因来制备转基因动物有很大的优势，其可操作性强，可以大量制备，是近几年发展起来的一项新的转基因技术。该方法同基因打靶技术相结合，可以同时提高转基因效率和精确度，在转基因动物研究中将会得到广泛的应用。但如何优化其操
10、作以提高转基因效率以更好的应用于转基因家畜等问题还有待进一步的探索。二、基因打靶技术基因打靶技术(Gene targeting technology)是指通过同源重组将外源基因定点整合人靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。2.1 胚胎干细胞(ES 细胞)基因打靶该方法利用 ES 细胞能在体外培养并保留发育的全能性，将改造后的外源基因导人 ES 细胞后，再把 ES 细胞注入动物囊胚，ES 细胞能够参与宿主细胞的胚胎构成，形成嵌合体直至达到种系嵌合，从而将带有外源基因的 ES
11、细胞传给后代，产生转基因动物。Bradly 等首次成功地用显微注射法将 ES 细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于 ES细胞系的纯系小鼠。1987 年，Thomas 等选择小鼠 ES 细胞为靶细胞进行基因打靶，建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型。通过基因打靶，不仅可以敲除特定的外源基因，还可以将外源基因转入动物基因组，获得基因敲入的转基因动物。美国犹他大学 Eccles 人类遗传学研究所科学家 Mario RCapecchi、美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院教授 Oliver Smithies
12、与英国科学家卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院 Martin JEvans 因为在利用胚胎干细胞对小鼠进行基因打靶的系列发现分享了 2007年诺贝尔生理学或医学奖。该方法中，ES 细胞提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系，利用 ES细胞作为载体，体外定向改造 ES 细胞，可使得基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行。目前，在 ES 细胞中进行同源重组已成为一种对小鼠染色体组任意位点进行遗传修饰的常规技术，该技术可以应用在研究基因功能和疾病模型方面。但是，至今尚未获得家畜的ES 细胞用于基因打靶，从而也限制了基因打靶在制备乳腺生物反应器等实际生产中的应用。2.
13、2 体细胞基因打靶在体细胞克隆技术成功之后，科学家们不再将基因打靶技术局限于 ES 细胞，而将基因打靶与体细胞核移植技术结合起来作为制备转基因动物的一种新的选择。首先设计合成一个将要导入体细胞的打靶载体，将此载体导人受体细胞，之后可以在体外培养条件下对整合外源基因的体细胞进行大量增殖和筛选，同时可以进行外源基因的表达分析，然后将整合并能高效表达外源基因的体细胞作为核供体，与核受体(一般是成熟卵母细胞)进行体外融合重构以形成克隆胚胎，再将克隆胚进行胚胎移植给代孕的母畜，从而诞生出某一基因发生定向改变的后代。PPL 公司的 McCrearh 等在 Nature 上报道了 COLIA1(原胶原)基因
14、在胎儿成纤维细胞内进行基因打靶，在 COLIA1 基因内插入了 IRES 和无启动子的neo 和 1-antitrypsin(AAT)基因，生产出转基因克隆绵羊，该羊乳中 AAT 蛋白含量高达 650 mgL。这是第一例通过核移植生产的体细胞基因打靶绵羊。在克隆动物制备过程中，提供体细胞核的供体动物如果与提供细胞质的受体动物不同，很可能会由于基因印记而导致核质的不协调，从而大大降低转基因克隆动物的制备效率。为解决这一问题，Yang 等选择将体细胞核移植到同一母牛的去核卵子细胞内，此克隆的同体重组胚中基因重排明显优于异体重组胚，其囊胚发育率也明显高于异体胚。另外，2004 年 Kuroiwa 等
15、应用该技术制备出无疯牛病的牛，2005 年 Wall 等制备了不发生乳房炎的奶牛，2006 年 Lai 等制备出能够合成多不饱和脂肪酸的猪。2008 年 Baldassarre 等报道，重组人丁酰胆碱酯酶(rBChE)在哺乳期山羊乳中的表达量可达到 15 gL。该技术绕过了需要 ES 细胞打靶的障碍，直接在体细胞中进行基因同源重组，体外筛选中靶细胞，通过核移植制备转基因动物。ES 细胞经过打靶修饰、筛选、扩增后仍保持进入生殖系的能力，但体细胞不同，用于克隆家畜的体细胞体外存活时间是有限的，尽管有些细胞在经过基因打靶进入核移植时仍具有全能性，但衰老的细胞打靶效率会降低，这也成为体细胞基因打靶的主
16、要限制因素。相信随着新技术的不断出现，靶受体细胞的培养传代、打靶以及核移植等相关技术会被攻破，从而提高体细胞基因打靶效率。由于该方法建立的转基因动物可高效表达体细胞中转入的外源基因，可以加快制备商业化生产水平的生物反应器及生产基因工程药物等的发展。2.3 条件性基因打靶外源基因整合到动物基因组中带有随机性，表现为整合位点的随机性和拷贝数量的随机性，这使得转入目的基因的表达有很强的不可控性。然而，在实际运用中往往需要使目的基因在特定组织或细胞类型中进行表达，或者使其在动物发育的某个阶段进行表达，因此，外源基因的时空可控表达成为人们迫切需要解决的问题。而条件性基因打靶则是一个绝佳的策略，具有很大的
17、应用价值。它主要是基于 CreLoxP 系统从而使打靶产生的变异在时间、空间或时空上都具有特异性，Gu 等利用这种策略首先实现了 DNA 聚合酶 B 基因在 T 细胞的灭活。该系统包括 Cre 重组酶和 loxP 位点两部分，其中 LoxP 由两个 l3 bp 的反向重复序列和 8 bp 的间隔区域构成，Cre 重组酶可识别 LoxP 位点，切除或置换两个 LoxP 位点间的 DNA 片段。因此可以通过给 Cre 重组酶 1 基因选择适当的组织特异性启动子，控制 Cre 重组酶基因在特定组织细胞中表达，保证基因表达的空问特异性。而 CreLoxP 系统通过两种方式保证了目的基因表达的时间可控性
18、：一种是在 Cre 重组酶基因的上游置人诱导剂依赖性的启动子，如四环素调控蛋白启动子、干扰素诱导性启动子等，根据需要在不同的时间给予诱导剂，启动转录使 Cre 重组酶表达，从而调控基因表达；另一种是将 Cre 重组酶基因与类固醇受体的配体结合域(Ligandbinding domain，LBD)基因结合，表达出的融合蛋白的重组酶活性需要在激素类诱导剂作用下才能被激活 。利用 CreLoxP 系统可以实现条件性基因敲除，即构建打靶载体时，在目的基因的两侧加上相同方向排列的 LoxP 序列，然后进行基因打靶制备转基因小鼠系。与此同时，再制备一种转入 Cre 重组酶基因的转基因小鼠，这两种小鼠交配后
19、即可产生同时含有以上两套基因的转基因小鼠。将 Cre 重组酶基因与诱导型启动子或类固醇激素受体的 LBD 融合，并为其选择适当的组织特异性启动子，则可以在动物个体出生后根据时间需要激活 Cre 重组酶，切除基因组中两个 loxP 位点之间的基因，实现目的基因在某个特定组织器官的局部敲除。这一策略特别适用于研究一些胚胎期必需基因的功能和广泛表达的基因在某一特定组织中的功能。相反，利用 CreLoxP 系统还可以实现条件性基因修复，如将两个 loxP 位点插入到某个功能基因中，即可根据时间需要通过药物诱导激活Cre 重组酶，切除两个 loxP 位点之间的片段使目的基因重新恢复功能。Rendahl
20、等首先将 CreLoxP 系统与胚胎干细胞的研究结合了起来。将PgkLoxPNeo 盒引入胚胎干细胞的目的基因座，Cre 酶表达 pgk 启动子被除去，同时 ES 细胞对 G418 的敏感性增加。这项研究有效地将单拷贝基因引入确定的基因座，加强了内源性调控元件控制转入基因的表达。由于细胞对 Cre 酶的吸收有限，从而限制了 CreLoxP 系统的应用，改进细胞对其的吸收效率也是 CreLoxP 系统研究的一项重要内容。Chenuaud 等研究了由 Kaposi 成纤维细胞生长因子改进的疏水肽，以及 HIVTAT 的基本肽对细胞吸收 Cre 酶效率的影响。结果表明当核定位信号与 Cre 的融合物
21、与 TAT 肽融合后使成纤维细胞、鼠胚胎干细胞对 Cre 的吸收增加到 95。总之，该系统利用组织专一性启动子对转基因表达保证了空间专一性，同时利用药物诱导系统对转基因表达保证了时间可控性，实现了定时、定位地对外源目的基因进行精确调控，达到了人为控制其表达的目的。可以利用此技术建立时空表达可控的转基因模型调控体系，对基因功能的研究具有十分重要的价值。三、RNA 干扰(RNAi)介导的基因沉默技术RNA 干扰(RNAi)是双链 RNA 介导的特异性基因表达沉默现象，自从 20 世纪末被发现之后，其基础研究和应用迅速成为 21 世纪初生命科学中的热点领域之一。利用该方法，可以部分地抑制特定内源基因
22、的表达，或通过 mRNA 的降解使目的基因表达下调沉默，从而实现基因表达调控的时空性和可逆性。双链小分子 RNA(siRNA)可通过互补序列特异地结合目标 mRNA，被结合的mRNA 将不再翻译而使动物表现出特定的性状改变。例如，2005 年 Acosta 等设计了斑马鱼 myostatin 基因的干扰片段并注入其受精卵，这段干扰片段即双链小分子 RNA 干扰了 myostatin 的表达并降低其 mRNA 水平，从而解除 myostatin基因对肌肉组织生长和发育的抑制作用，产生肌肉发达的斑马鱼。2006 年，Pfeifer 等将能使 PrP 基因沉默的 siRNA 序列转入原核小鼠细胞核内
23、，这些胚胎发育成小鼠后，再把感染性“搔痒病”朊病毒注射到小鼠的大脑中；脑细胞含有 siRNA 的小鼠的存活时间比普通小鼠大大延长。该技术有望用于抗羊搔痒病的转基因羊新品种的培育。近几年已经开发出时空 RNA 干扰技术，通过控制干扰基因的转录，实现对RNA 干扰的控制。2007 年，Dickins 等将启动子四环素反应元件(Tetracyclinresponse element，TRE)与 RNA 干扰基因结合后转入小鼠中，成功转入的小鼠再与转有转录因子(tTA)的小鼠杂交，制备出同时含有 TRE、RNA干扰基因以及 tTA 的转基因小鼠。利用给予这些小鼠四环素药物，来激活 tTA 系统并使之与
24、启动子结合，进而激活 TRE，从而启动 RNA 干扰。由于并不是所有的 siRNA 都能起到抑制效果，因此 RNAi 应用的重要问题是如何设计有效的RNAi 序列，并使其在细胞内长时间稳定的表达。虽然 RNAi 现象的机制目前还没有完全弄清楚，涉及到很多不明功能的酶和蛋白质，但该技术有望被广泛用于基因功能分析和疾病治疗的研究中，推动分子生物学、医学等的进展。如利用 RNAi 可以降低或抑制某些基因的表达，建立相应的动物模型用于病毒性疾病治疗和预防，将会是一个具有广阔发展前景的领域。也可以将 RNAi 技术与其他转基因方法如体细胞克隆法相结合，定向地生产转基因动物用于研究与生产。四、诱导多能干细
25、胞转基因技术诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS cells)是将几种转录因子转入已经分化的体细胞中，使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。iPS 细胞同样具有自我更新和分化的全能性，其功能与胚胎干细胞类似，无需制造胚胎，从任何组织的细胞都可以制造出具有干细胞功能的细胞，避免了转基因面临的伦理问题，更重要的是简化了制备转基因动物的过程。iPS 产生机理与相关技术的深入研究，将会给治疗人类疑难疾病、组织修复与再生以及生物制药：等诸多生物医学领域带来新的发展机遇。2006 年日本京都大学 Takahashi 等将携带有 Oct4、Sox2、Klf
26、4 和 c-Myc 4 种限定因子基因的逆转录病毒载体导入小鼠成纤维细胞，结果显示转入限定因子的成纤维细胞被诱导重编程为胚胎干细胞样的多能性细胞，该细胞被称为“诱导多功能干细胞”(iPS 细胞)。一年后，研究人员又成功的将人的皮肤成纤维细胞诱导为 iPS 细胞。2009 年 7 月，美国细胞干细胞杂志和英国自然杂志分别报道了我国科学家利用 iPS 细胞培育出哺乳动物的消息，北京生命科学研究所高绍荣博士和中国科学院动物研究所周琪博士领导的研究小组分别利用 iPS 细胞，通过四倍体囊胚注射得到了存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了 iPS 细胞的全能性。这期间许多实验室针对这一领域展开研究，产生了一系
27、列新的研究成果。例如由于 c-Myc 为癌基因，它的重新激活会导致 iPS 细胞的高致瘤性，针对这一问题，Nakagawa 等将 c-Myc 因子从 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 4 个限定因子中去除，结果有效地分离到 iPS 细胞，只是 iPS 细胞产生的效率明显降低。但是该实验获得的 iPS 细胞特异性高、质量好，并且其多能性标记基因的表达水平更接近于 ES 细胞，产生的后代小鼠的致瘤性也大大降低。研究发现如果体细胞内某种限定因子的表达量合适，在重编程过程中可以去掉该因子而不影响结果。如在小鼠神经干细胞内，Sox2 和 c-Myc 的表达水平比 ES 细胞高，因此 Kim
28、等分别将 Oct4 和 Klf4、Oct4 和 c-Myc 两组限定因子导入神经干细胞，也成功地将其诱导为 iPS 细胞。另外，研究证明某些小分子化合物可以促进重编程，甚至可以替代限定因子。如在转入 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 4 种因子诱导小鼠成纤维细胞时，若加入维甲酸(Valproic acid，VA)可以明显提高其重编程效率，即使在去掉癌基因 c-Myc 时也能保持效率不下降，从而有效避免了诱导细胞癌变的可能。在对限定因子进行研究的同时，科研人员也展开了对其载体的探索，如利用来自病毒的 2A 肽序列生成一种结合限定因子的“多顺反子载体”(Multicistronic v
29、ector)，该载体被 piggyBac 转位子载体送入细胞中，进而在人和小鼠成纤维细胞中都生成了稳定的 iPS 细胞。综合近两年的实验成果，可以推测小鼠的任何体细胞都有可能通过病毒载体转染限定因子的方法诱导成为 iPS 细胞。在iPS 细胞报道后短短两年多的时间内，iPS 细胞的研究就受到了人们广泛的关注，体细胞重编程、去分化和多潜能干细胞来源等一系列热点问题再次成为干细胞研究的热点和焦点，同时也为转基因动物的研究提供了全新的思路。iPS 细胞的功能同 ES 细胞非常相似，具有多向分化的潜能。同普通细胞一样，iPS 细胞能够作为转基因的靶细胞，可以通过一定的转基因技术将外源基因转入 iPS
30、细胞，也可以针对 iPS 细胞进行基因打靶或基因敲除等遗传修饰，从而根据人的意愿实现 iPS 细胞内基因改造，然后将其注入囊胚腔来获得嵌合体后代，高效、定向的生产转基因动物。另外，将 iPS 细胞应用到体细胞核移植技术是一个非常不错的选择，利用 iPS 细胞作为核供体细胞，同适当的受体细胞融合后便可以直接获得转基因动物。因此，在转基因动物研究中，将 iPS细胞诱导技术同动物转基因技术相结合是一种创新，应用该方法不仅可以避免种间繁殖障碍，克服亲缘关系的制约，而且可获得用传统的交配方法无法得到的动物新性状。与 ES 细胞相比，iPS 细胞具有明显优势，其避免了分离 ES 细胞时对大量优质胚胎的破坏
31、而且 iPS 细胞容易获得，普通的体细胞即可诱导产生。另外，由于 iPS 细胞强大的可塑性，使基因的遗传修饰更加高效，转基因动物的制备也更加方便快捷。iPS 细胞的应用在转基因动物生物反应器以及人源性疾病动物模型的制作等方面具有深远的意义。但是，目前这一技术刚刚起步，还有许多问题等待解决，例如如何提高 iPS 细胞的诱导效率，如何保持 iPS 细胞多能性，如何定向可控的诱导 iPS 细胞等。随着研究的不断深入，这些问题都会得到更好的解决，进一步促进动物转基因技术的发展。五、问题与展望动物转基因技术是人类按着自己的意愿去改变动物的遗传组成，涉及生物学、畜牧学、分子遗传学和细胞遗传学等多门学科的、
32、富有挑战性的实验技术。动物转基因在改善畜产品质量、提高生产能力、研究人类疾病模型、生产生物医药产品等方面都显示出了广阔的应用前景。然而，转基因动物在研究过程中也存在着一系列迫切需要解决的问题：首先，目前转基因动物研究存在理论基础积累不足的问题，特别是对转基因过程中的精细理论及其过程不甚清楚；其次，转基因技术支撑体系不够完善，致使目前转基因动物的成功率和成活率极低，这是限制转基因动物发展的主要因素；第三，外源基因在目的基因中的整合率低，效果不稳定。可能对内源基因产生影响，对宿主基因组造成破坏，也可能激活动物正常情况下关闭的基因，使其表达，进而导致动物出现异常；第四，基因打靶等技术环节还有待于成熟
33、，这就需要研究者综合转基因技术的基础理论和技术实践，不断探索，寻找更实用更完善的技术方法；第五，转基因动物还存在一些安全性问题。比如外源基因的插入可能对宿主动物自身有影响，造成基因污染，对生态平衡以及物种的多样性造成威胁；第六，转基因动物制品可能存在有毒性或过敏等食品安全性问题；第七，转基因移植可能加大“人畜共患病”的传播机会，危害人类健康等。因此，要认真考虑转基因动物的安全性问题，修改或制定相关的法律法规，在保证安全的前提下，使转基因动物发挥其最大的优势，造福于全人类。自转基因动物问世以来，动物转基因技术得到迅猛发展，为转基因动物的制备提供了更多更好的平台。通过生殖干细胞法提高了转基因的效率
34、，通过基因打靶技术实现了外源基因的定点整合，而发展基因打靶技术，将其与 RNA 干扰结合在一起，使目的基因表达的时间和空间可控性成为可能，也为基因的精确调控提供了全新的途径。另外，转基因动物又能够作为 microRNA 功能研究、iPS 细胞研究等近几年一系列热点问题的研究工具，新的技术提供了更多新的思路，从而给人类的医药卫生、家畜改良等领域带来革命性的变化，特别是作为生物反应器以及在药物生产和供人类移植所用器官的生产等方面，其经济效益和社会效益将是难以估量的。但是现在转基因动物的应用主要集中在医药方面，在食品工业上的应用很有限，主要原因是转基因的效率太低，建立优质转基因动物品系的时间太长。今
35、后的工作还应集中在现有的技术水平上建立更加简便、经济、有效的转基因技术，制备出外源基因稳定遗传的有生产应用价值的健康动物。随着家畜基因组计划的完成，人类将更有针对性地改良家畜基因，把外源基因插入到对动物生长影响较小的 DNA 片段中，从而克服随机整合和异常表达给家畜健康带来的问题，而基因打靶等新的转基因技术创造了这种可能。同时，转基因技术的发展需要更多的相关法律法规给予一定的支持。总之，转基因动物研究是一个需要不断探索和创新的过程，寻找简易、可靠、高效的转基因技术成为转基因动物的关键。纵观这 30 多年的发展，相信经过科学工作者的不断探讨，结合各种生物技术，不久的将来会发展出更加简便、更加新颖
36、的动物转基因技术，更多的转基因动物及其相关的产品必将走向产业化和市场化，改善人们的生活水平，对人类的生产和发展起推动型的作用。参考文献：1林莉，胡佐忠. 转基因动物技术的研究进展. 畜禽业，2005 年第 5 期； 2转基因动物新技术研究进展，北京农业信息网； 3连庆，王伟威. 我国转基因动物研究进展及安全评价管理. 江苏农业科学，2012 年第八期； 4孙凤俊， 张佳谊, 韩广文. 动物转基因技术研究进展及其应用前景 . 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集；5 冯登侦，陈泽明，冯梅秀. 动物转基因技术及其研究进展. 宁夏农学院学报，2003 年第二期；6潘伟荣，霍金龙，查星琴，张清政，牛自兵，曾养志. 转基因动物的研究进展与应用前景. 畜牧与饲料科学， 2008 年第六期；7刘西梅，乔宪凤，张立苹，程妮，毕延震，李莉，肖红卫，华再东，华文君. 转基因动物研究的技术思路. 湖北农业科学，2012 年 11 月第 21 期.
