1、中青年优秀论文评奖茶多酚对大鼠脑缺血-再灌注损伤后细胞凋亡和 p38 信号通路的影响西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科 710004赵红霞 薛荣亮 魏欣 高慧 蔡英敏【摘要】目的 探讨茶多酚对全脑缺血再灌注后大鼠海马 CA1 区凋亡细胞及 p38 信号转导通路蛋白表达的影响。方法 健康清洁雄性 SD 大鼠 108 只，随机平均分为 3 组，每组设6 个时间点，每个时间点 6 只。分别为：缺血再灌注组（IR，n=36） ，假手术组（PO ，n=36） ，茶多酚干预组（TP，n=36） 。各组均采用四血管阻塞法建立全脑缺血再灌注损伤模型，TP 组在再灌注结束后立即给予腹腔注射茶多酚 200mg/
2、kg，其余各组则给予腹腔注射等量生理盐水。各组在预定时间点提取脑组织制备病理切片，HE 染色观察海马CA1 区神经元形态结构改变；免疫组化染色观察磷酸化 P38 蛋白的表达；TUNEL 染色计算细胞凋亡指数。结果 脑缺血再灌注后 海马 CA1 区凋亡细胞在 PO 组少量表达，在 IR 组表达显著增多(Po 05) ，而 TP 组于各时间点凋亡细胞表达介于 IR 组和 PO 组之间(Po05)；与 PO 组比较， IR 组在再灌注后各时点 p38 蛋白表达显著增强(P005)，TP 组较 PO 组表达增强但较 IR 组表达减弱(Po05) 。结论 茶多酚可抑制大鼠全脑缺血/再灌注时 p38 蛋白
3、的活性，进而减少海马椎体细胞凋亡，对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用。【关键词】 茶多酚； 脑； 缺血/再灌注损伤； 凋亡； P38 蛋白The impact of Tea Polyphenols on apoptosis and P38MAPK Signaling Pathway after Cerebral Ischemia/ Reperfusion injury in rats【Abstract】 Objective To investigate the impact of Tea Polyphenols on apoptosis and P38MAPK Signaling Pathway
4、 after Cerebral Ischemia/ Reperfusion injury in rats. Methods 国家自然科学基金资助项目（30571790）108 healthy clean SD rats were randomly divided into 3 groups: Pseudo-operation group(PO group, n=36), ischemia/reperfusion group (IR group, n=36) and tea polyphenols group (TP, n = 36). each group with 6 pionts,and
5、each pionts have 6 rats. Global cerebral IR was produced by 4-vessel occlusion method. In TP group 200 mg/kg Tea Polyphenols was given when reperfusion was end, at the same time, in PO group and IR group was given normal saline. to extract the brain tissue and to make the Pathology Slice in Schedule
6、. To investigate the form and the structure of neurons in hippocampal CA1 region; Phosphorylated p38 expression was assessed by immuno-histochemistry; to observe the apoptosis by TUNEL staining. Results After Cerebral Ischemia/ Reperfusion injury, the apoptotic cells expressed less in PO group, in I
7、R group it was increased notablely(Po05),and in TP group , the apoptotic cells expressed between PO group and IR group(Po05) ;to Compared with PO group, the express of p38 protein increased notablely in IR group(Po05), and in TP group , it was expressed between PO group and IR group(Po05). Conclusio
8、n after Cerebral Ischemia/ Reperfusion injury ,the Tea Polyphenols can restrain the active of the p38 protein, therefor, the apoptotic cells was Reduced, so the Tea Polyphenols can be to protect the nerve cells.【KEY WORDS】 TP; brain; ischemia/ reperfusion injury; apoptosis P38 protein既往研究表明，p38MAPK信
9、号转导通路激活后参与了多种应激所介导的细胞凋亡 12。已经证实，通过应用特异性p38蛋白抑制剂后可以显著减少脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的发生。茶多酚是一种理想的天然食品抗氧化剂，具有抗癌、抗衰老、抗辐射、清除人体自由基、降低血糖血脂等一系列重要药理功能 3。本文旨在研究脑缺血再灌注损伤后应用茶多酚对p38MAPK 信号转导通路蛋白和细胞凋亡的影响，证实其是否有脑保护作用。1 材料和方法1.1 材料 健康清洁雄性 SD 大鼠 108 只，由西安交通大学医学院动物中心提供，鼠龄 50-60 日，体重为 270g20g。在严格的生物实验条件下饲养 1 周，术前经检查，确认无异常行为后可进行实验。术前
10、夜禁食，随意进水。茶多酚(购自美国 Sigma 公司)，SABC 免疫组织化学试剂盒（购自北京博奥森生物技术有限公司） ，原位末端标记细胞凋亡试剂盒（购自美国 Promega 公司） ，磷酸化 p38 兔抗多克隆抗体（购自北京博奥森生物技术有限公司），DAB 显色试剂盒（购自北京博奥森生物技术有限公司） 。1.2 方法1.2.1 动物分组 将实验动物随机分成 3组：假手术组（ PO组） ，缺血/ 再灌注组（IR组）和茶多酚干预组（TP） 。每组根据再灌注时间不同再分为 2h、6h、12h、24h、48h和72h 6个亚组，每亚组6只动物。1.2.2 模型制作 采用4-VO 4法建立SD大鼠全脑
11、缺血/ 再灌注损伤模型。10%水合氯400mg/Kg对大鼠腹腔注射施行麻醉（所有动物麻醉均与此相同） ，待翻正反射消失后，俯卧位固定，枕骨下第一颈椎水平正中切口，逐层分离肌肉，暴露第一颈椎横突上的翼小孔，翼小孔下有两侧椎动脉通过，用烧红的探针插入翼小孔，烧灼双侧椎动脉，使之永久闭塞。后逐层缝合皮下及皮肤。放回鼠笼，单笼放之，室温保持在2025。术后第二日，同样方法麻醉后仰卧位固定，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，予以微动脉夹夹闭6min ，双侧颈总动脉被夹闭后造成持续性全脑缺血。期间密切观察其生命体征变化，可见大鼠瞳孔散大、眼球苍白、嘴唇发绀，呼吸急促（颈总动脉夹闭2min 内瞳孔不散大者予以
12、剔除） 。不符合上述标准或出现偏瘫者不列入实验动物总数。PO组仅游离暴露双侧颈总动脉及椎动脉，不予以凝断椎动脉和夹闭双侧颈总动脉处理。TP组于再灌注6分钟后给予腹腔注射茶多酚200 mgkg，其余各组给予注射等量的生理盐水。1.2.3 标本采集和组织切片制作 实验大鼠按要求于再灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h给予10%水合氯醛400mg/Kg腹腔注射麻醉后，沿剑突横向将腹壁各层剪开暴露出心脏，然后用9 #针头从心尖插入主动脉，固定针头防止血液逆流，剪开右心房，用加有肝素的PBS液100 ml快速灌注，见大量血液从右心房涌出，肝脏逐渐变白。再用4%多聚甲醛250ml灌注置换血液，
13、直至大鼠四肢抽搐，四肢蜷缩，尾巴伸直，全身僵硬为止。用镊子沿枕骨撬开颅骨，取出完整大脑，在视交叉后1 mm和4 mm处各切一刀取中间小块脑组织，将组织块在4%多聚甲醛液中浸泡， 4保存3d后制备切片。将所得脑组织块用清水浸泡24h后再分别置于80%酒精、95%洒精、100%酒精I 和100%酒精II中各浸泡2h进行梯度脱水，然后再移入二甲苯I和II中各浸泡 1h，最后在温度为 58的I、II 、III熔蜡中分别浸泡40min、40min、50min后，快速取出进行石蜡包埋，蜡块在20室温下冷却24小时后至于4保存。需要时在切片机上沿冠状面切成5 m厚皮质薄片。 HE染色，在高倍镜（4010）下
14、观察海马CA1区细胞形态结构的改变。免疫组织化学SABC法染色，按说明书操作切片中显示细胞核呈棕色颗粒者为磷酸化p38阳性细胞，在400倍光镜下计数海马CA1区中1/3段内磷酸化p38染色阳性细胞数目。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，求得阳性细胞率。TUNEL染色，切片中显示细胞核有明显的棕黄色颗粒或斑片者为阳性细胞。定量分析方法为：光镜下计算凋亡指数。凋亡指数(apoptosis index ，AI) 计算方法：400倍光镜下观察每张切片海马CA1区，随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，分别计算凋亡细胞数和总细胞数。AI=凋亡细胞数/ 总细胞数100%。统计学处理
15、计量资料以均数标准差（ s）表示，采用 SPSS13.0 软件包进行统计学处理。组间比较采用方差分析及 LSD-t 检验 ，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 HE染色结果：PO组海马CA1区椎体细胞3-4层，细胞质呈淡红色，细胞核呈蓝黑色，高倍镜下细胞核大而圆，核仁清晰。IR组可见神经元数目减少，胞体缩小，胞膜与周围分界清楚，胞浆嗜酸性样变，核浓染、固缩、核仁消失。TP组组织形态学改变介于上述两组之间，幸存神经元与缺血性改变神经元相间分布。 （图1）2.2 磷酸化 p38 蛋白免疫组化显示：PO 组磷酸化 P38 蛋白在大鼠海马 CA1 区椎体细胞各时间点均可见微弱表达，IR 组
16、于再灌注 2h 后可见表达于胞浆，之后表达逐渐增强，阳性细胞率逐渐上升，再灌注 48-72h 表达最强，之后表达逐渐下降，与 PO 组比较差异具有统计学意义（P0.05） 。TP 组各时间点磷酸化 P38 蛋白表达介于上述二者之间。与 IR 组比较差异具有统计学意义（P0.05） 。 （图 2） （表 1）2.3 TUNEL 法检测细胞凋亡结果 PO 组海马 CA1 区在各时间点可见极少量阳性细胞； IR组凋亡细胞在 2h 开始出现，6h 后阳性细胞逐渐增多，凋亡指数在 48h 增至高峰，72h 又有所下降。TP 组各时点海马 CA1 区阳性细胞凋亡率介于上述而组之间。 （图 3） （表 2）
17、表 1 茶多酚治疗后各时点海马 CA1 区磷酸化 P38 蛋白阳性细胞率（ s）比较x组别 2h 6h 12h 24h 48h 72hPO 5.670.56 5.730.78 7.781.54 6.891.43 5.960.65 8.031.32IR 12.021.76 17.341.43 18.871.82 19.541.78 23.761.76 18.881.43SH 15.621.54 19.651.97 25.722.53 26.232.54 28.543.05 26.563.09与 PO 组相比， P0.05；与 IR 组相比， P0.05。表 2 茶多酚治疗后各时点海马 CA1 区
18、椎体细胞凋亡指数比较（ s）x组别 2h 6h 12h 24h 48h 72hPO 1.430.56 1.760.78 1.930.69 1.890.73 2.110.71 1.930.79IR 8.835.12 13.546.32 26.164.27 27.215.73 30.235.45 25.456.34GH 7.560.45 13.671.45 18.372.20 19.192.39 21.542.27 20.182.42与 PO 组相比， P0.05；与 IR 组相比， P0.05。PO组 IR组 TP组图 1 光镜下缺血再灌注 48h 海马 CA1 区形态学（HE400）PO组 I
19、R组 TP组图 2 48h 海马 CA1 区 TUNEL 染色（400）PO组 IR组 TP组图 3 光镜下缺血再灌注 48h 海马 CA1 区 p38 蛋白表达 （免疫组化，400）3 讨论脑缺血/再灌注损伤后引起的细胞死亡有坏死和凋亡两种形式，坏死的发生呈级联反应，似乎无法干预，而凋亡的发生则比较滞后，资料显示，在脑缺血再灌注后2-4天都可以观察到凋亡的发生，因此，针对凋亡的干预应该成为临床研究的重点。研究发现，p38MAPK通路在炎症、应激反应中具有重要作用，还参与细胞的存活、分化和凋亡等过程 5。本实验结果显示，大鼠全脑缺血24h后，p38活性开始增高，34天后达到峰值。同时，细胞凋亡
20、检测结果显示：脑缺血/再灌注损伤后，凋亡细胞在 6h开始增多，2448h达到高峰，72h开始下降。二者的发生在时间上具有一致性，且p38蛋白含量的高低与细胞凋亡程度呈正相关。这一结果表明，p38MAPK通路在脑缺血/ 再灌注损伤中起重要作用，即在细胞凋亡的早期即被激活而诱导和加重细胞凋亡的发生。茶多酚是一种强效的天然抗氧化剂，具有多种生物学功能，研究发现，其在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用，主要机制可能与抑制N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和海人藻酸受体介导的Ca 2+内流有关 6。其次，茶多酚可以清除细胞毒性NO和其下游产物。Lee H7发现在沙土鼠的单侧颈总动脉结扎后，EGCG可明显
21、抑制谷氨酸介导的兴奋性毒性，减少MDA 生成，减少脑水肿和减少梗塞脑组织的体积。NagaiK等在对大鼠大脑海马缺血10分钟后发现NO明显上升，用EGCG 可使NO的上升率下降77%，但不影响海马区的血流。本实验研究结果显示，大鼠全脑缺血/再灌注损伤后，茶多酚在各个时间点都可以通过抑制p38MAPK通路的活性而发挥脑保护作用，减少由全脑缺血/再灌注损伤引起的神经细胞坏死和凋亡，从而为临床治疗常见的休克，呼吸心跳骤停等提供新的思路。但基于目前的研究现状，还无法达到这一目的，期待在今后的研究中有更佳的发现。参考文献1 杨丽松，周琴，李卫平茶多酚静脉给药对动物缺血性脑损伤的保护作用J大连医科大学学报，
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