1、2018年9月5日星期三,1,生物电子显微术,河北农业大学生命学院,2018年9月5日星期三,2,生物电子显微术,1 绪论 基本概念 EM发展史 EM分类及特点 电镜技术的应用 各种显微镜性能与特点的比较 2 电子显微镜的基本知识 TEM的结构和原理 SEM的结构和原理,2018年9月5日星期三,3,3 超薄切片技术 基本概念 普通超薄切片技术 4 负染色技术 5 金属投影和复型技术 金属投影技术 复型技术 6 EM冷冻制样技术 概述 冷冻超薄切片技术 冷冻断裂(蚀刻)及复型技术 冷冻安全规则,2018年9月5日星期三,4,7 SEM的样品制备技术概述 SEM电镜的样品制备 特殊样品的制备 8
2、 电镜的应用(个案分析） 花粉表面形态的SEM观察 熏蒸固定真菌的SEM观察 样品包埋块的制作 扫描电镜观察石蜡切片观察法 植物原生质体超薄切片的制作 真菌菌丝及孢子的包埋,2018年9月5日星期三,5,9 X-ray显微分析 X-ray微区分析的基本原理 X-ray显微分析仪工作的基本原理 X-ray显微分析的方法及应用 10 其他显微技术 扫描隧道显微镜 原子力显微镜 激光扫描共焦显微镜 扫描电-声显微镜,2018年9月5日星期三,6,生物电子显微术,课时安排 讲授：30学时 实验：10学时 主要内容： 电镜的原理、结构（TEM，SEM） 电镜的样品制备技术1) 超薄切片技术 4) 金属投
3、影及复型技术 2) 负染色技术 5) SEM制样技术3) 冷冻制样技术 6) 其他制样技术 应用举例,2018年9月5日星期三,7,主要参考文献,生物电子显微术 张景强 中山大学出版 实用生物电子显微术 林钧安 辽宁科技出版 生物电子显微术教程 陈力 北师大出版 电子显微镜与电子光学 黄兰友 科学出版 生物医学电子显微技术 程时 北医、协和 生物学工作者实用生物电子显微术 英G 1976,参考文献1，2，3图书馆均有,2018年9月5日星期三,8,第一章 绪论,1.1基本概念 1. 电子显微镜：简称电镜利用电子束作为照明源，电磁透镜聚焦成像，并结合特定的机械装置，应用现代电子技术、高真空技术而
4、制成的一种精密电子光学仪器。TEM：Transmission Electron MicroscopeSEM： Scanning Electron Microscope,2018年9月5日星期三,9,2电子显微术：以电子显微镜为工具，对物质（样品）进行物理、化学、成分、超微结构等方面研究的一种技术。电子显微术定义: 电子显微学是凝聚态物理、材料科学、乃至生命科学的交叉学科，是物质科学研究的一个重要组成部分。它是以电子显微学等方法, 在原子尺度上对物质的微观结构进行研究分析, 从而促进了新物质、新结构、新性能、新现象的发现，极大地推动了新材料、新器件的发展。,2018年9月5日星期三,10,3超微
5、结构：指一般光学显微镜不能分辨的细微形态结构（亚显微结构），直至生物大分子结构（蛋白质、核酸、多糖、脂类）。 4电子显微方法：Electron Microscopy指利用电子与固体样品作用时所发出的信息，对样品进行微区观察和分析的一种方法。1mm=103 m 1m=103nm 1nm=10 1 =10-10m,2018年9月5日星期三,11,1.2 电子显微镜的发展概况 光学显微镜的发展(LM: light microscope) 光镜的诞生 人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的两点之间的最短距离用“”表示 13世纪玻璃的发明 制造眼镜、放大镜 16世纪 欧洲放大镜=0.01 M=330倍 1590
6、年 荷兰眼镜商Hans之子-Janssen装配具有划时代意义的“显微镜” 1665年 英国物理学家Robert Hook(虎克) 第一台光学显微镜 1675年 荷兰Leeuwen.Hook(列文.贺克 M=270倍, 共研制247台光镜 高倍率的光镜 18世纪到19世纪中叶 英、法、意相继研制消色差显微镜 M=15002000 人的视力提高了1000多倍0.2 m,2018年9月5日星期三,12,3. 光镜的局限性 1878年 德.理论光学家 E.Abbe提出光镜的最优分辨率 opt=0.4*光 波的反射,水波,障碍物:石块,产生的影子,芦苇杆,表1-1 电磁波各光谱区的一些参数及相应的结构分
7、析方法,2018年9月5日星期三,14,可见光波长 40008000 opt=0.4*光紫外线波长 =3900130 紫外线显微镜opt=1000 X-ray =1000.5 但无法偏转不能成像 目前,光镜最好分辨率opt=0.160.32 m 结论:利用波长的更短光线做照明光源,可提高分辨率。（OR：波长越短，分辨率越高）电子波波长很短易于成像，从而导致电镜的产生和发展,2018年9月5日星期三,15,电镜的发展 国外情况电镜产生的三大理论基础Thomson（1897）证明电子的存在L.de.Broglie(德.1923)提出微观粒子的波粒二相 性H.Busch(德.1926)建立几何电子光
8、学理论 电子的存在 19世纪50年代 德.波恩Geissler,2018年9月5日星期三,16,1858年,Pluker(德.波恩物理学家),发现阴极射线 1881年,Hertz(赫兹)只认识到阴极射线具有波动性 1897年, Thomson证明阴极射线是带电粒子 其荷质比为1011C/Kg 波粒二相性 法国. L.de.Broglie提出:一个动量为P,能量为E的自由运动的电子,相当于波长为 =h/p,频率为V=E/h,并沿着粒子运动方向传播的平面波.电子束既有粒子性,也有波动性。,2018年9月5日星期三,17,几何电子光学理论电子光学：指研究和利用电子流的偏转、聚焦、成像规律的一门学科。
9、 1925年，柏林工学院M.knoll 和 A.Matthias尝试做聚焦的电子束透镜 1926年， H.Busch 带有铁轭的短磁透镜聚焦理论 D.gabor(M.knoll 的学生）包壳透镜(1948年提出全息技术 全息技术之父并获诺贝尔奖) 1928-1929, Ernst.Ruska 极靴磁透镜,现代磁透镜 透射电镜的诞生 1932年， M.Knoll 和他的学生E.Ruska发明了电镜 ,放大倍数16倍;改进后75Kv, 1.2万倍 1939年,西门子制造第一台商品透射电镜 1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌体,建立第一个开放实验室 1986年Ernst.Ruska和Ge
10、rd.Binnig、Heinirich.Rothrer获得诺贝尔物理奖,2018年9月5日星期三,18,扫描电镜的诞生 1935年， M.knoll 设计第一台SEM 1956年，二次电子探测器出现 1956年， SEM商品化 国内情况 校外状况 TEM 1953年，长春光机所第一台 XD-100型 100kv TEM 1965年，中科院科仪厂 DX-2型TEM 100kv 5 1970年，上海新跃仪表厂 DXB1_12型TEM 40万 1977年，上海新跃 DXB2_12型TEM 80万 2 SEM 1975年，中科院科仪厂 第一台SEMDX-3 100 DX-5 60 1980年，中科仪
11、KYKY-1000B 1993年，中科仪 KYKY-2000 KYKY-2800 KYKY-2800B KYKY-3800,2018年9月5日星期三,19,STM (scanning tunneling microscope) 1987年，中科仪、中科院化学所白春礼等研制 第一台STM SSX-1型 国产电镜的缺点：制造工艺粗燥、自动化程度低、清洁度差 我校情况 1980s DX-2型TEM 1996年， KYKY-2800型数字式扫描电镜 分辨率6nm，放大倍数10万,2018年9月5日星期三,20,1.3 EM分类及特点 透射电镜（TEM） 原理：利用TE，整幅像同时成立，在荧光板上成象
12、特点： 样品超薄 h1000 二维平面像、立体感差 分辨率高 opt=2 样品制备复杂 观察对象：样品内部超微结构 扫描电镜（SEM） 原理：利用SE，逐点成像，显像管上成象 特点： 图象立体感强、可观察一定厚度的样品,2018年9月5日星期三,21,样品制备简单，可观察较大的样品 分辨率高，3040 倍率连续可变，从4倍15万倍 可配附件，进行微区的定量、定性分析 观察对象：样品表面微观结构 扫描透射电镜（STEM） 兼顾SEM/TEM的特点、造价高、可观察较厚样品(0.204m) 分辨率不如TEM高,高分辨型0.30.5nm;附件型1.53nm 在200KV时，辐射损伤小、污染小 能过检测
13、到扫描透射电子，获取更多超微结构信息 图像的反差和亮度易调节，切片可以不染色 显像方式：荧光屏、显像管 观察对象：表面、内部,2018年9月5日星期三,22,超高压电镜（UHVEM:ultra-high voltage electron microscope）HV500kv为超高压电镜，Hvmax=3MV其特点： 穿透能力强、可观察较厚的样品 m 级 分辨率高，2 （晶格分辨率） 单色性好，色差小，成像质量好 辐射损伤小 体积庞大、结构复杂、价格昂贵、需专用的防护装置 观察对象：主要非生物材料的晶格结构、观察细胞骨架 系统（微梁、微丝）,2018年9月5日星期三,23,分析电镜（AEM:ana
14、lysis electron electron microscope )连续X-ray 背底扣除能量：Z 特征X-ray的能量特征X-ray 波长： Z 特征X-ray的波长 波谱仪（WDS）Wavelength-disperse spectrometer微区定量分析，4Be 92U 慢2060分，灵敏度高 能谱仪（EDS）Energy- disperse spectrometer微区定性分析，11Na 92U 快23分，灵敏度低,2018年9月5日星期三,24,低压扫描电镜（LVSEM:low voltage）HV=1Kv，可观察绝缘物质、生物样品试样不易发生充放电效应 生物分析电镜（BAT
15、EM:biologic analysis ）TEM+EDS（or：WDS）分辨率高 =1.5 、分析性能好 扫描隧道显微镜（STM:scanning tunneling microscope）M=1000万倍，水平1 ， 垂直0.1 可进行“活体”观察、可在大气、液体环境下直接观察物质表面特征只能观察导体和半导体的表面结构、非导电的物质需要覆盖一层导电薄膜STM主要用于研究表面科学、半导体材料、生命科学,2018年9月5日星期三,25,优点：可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同试
16、验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。 STM在生物领域的应用：STM在生物和有机材料一领域有着广泛的应用前景。尽管目前还存在着如何解释生物样品的STM图象、如何更好地制备生物样品以及选择合适衬底以沉积生物分子等问题，但实际应用中已取得了不少好结果。例如在真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。 STM在纳米科技中的应用：STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。由微观到宏观，即直接操纵单个原子和分子，对它们进行排列组合，以形成新的物质，或制造出一定功能的机器这是实现纳
17、米加工的新思想，STM的出现使这一思想变为现实。自从STM问世以来，STM作为一种纳米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻写、电子束诱导沉积以及单原子操纵等方面，并取得了一批高水平的研究结果。,2018年9月5日星期三,26,硅111面7 7原子重构象硅片是大家熟悉的制作晶体管和大规模集成电路的半导体材料，为了得到表面清洁的单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发生较大变化，这就是所谓的重构。,2018年9月5日星期三,27,液体中观察原子图象 下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶(111)表面的STM图象。图中硫酸根离子吸
18、附状态的一级和二级结构清晰可见。,2018年9月5日星期三,28,1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。,2018年9月5日星期三,29,科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的.,2018年9月5日星期三,30,这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。,2018年9月5日星期三,31,DNA分子拉成的DNA图象,2018年9月5日星期三,32,原子
19、力显微镜（AFM：atomic force microscope) 导电样品、非导电样品均可观察 分辨率达到原子水平 可以在真空、超高真空、电化学环境、常温低温条件下工作应用于表面科学、生命科学、材料科学注：以STM、AFM为基础，衍生出扫描探针显微镜（SPM ：Scanning probe microscope ）：如激光力显微镜（LFM）、扫描电化学显微镜（SECM）,2018年9月5日星期三,33,环境扫描电镜（ESEM） 特点： 多种真空状态：高、低、超低真空1Torr=1mmHg柱压力=1/760大气压=133.3Pa粗真空：76010乇低真空：1010-3乇高真空：10-310-8
20、乇超高真空：10-8乇以下多种真空条件下可得SE像、BE像，且 =4nm 样品室可充气体:水气、氮气 动态分析：样品温度从-185 1000 制样简单：样品无须镀膜、脱水干燥 真正的“环境”条件，可直接观察含水、含油样品 缺点： 造价太高 $30万 Philips,低气压空间,2018年9月5日星期三,34,1.4 电镜技术的应用 生物科学方面： 细胞生物学 分子生物学 动物学和植物学 微生物学 医学科学 基础医学 临床医学 农林畜牧科学 植物保护 良种繁育（遗传育种） 土壤改良与成分分析 动植物疾病的快速诊断与防治,2018年9月5日星期三,35, 材料科学 机械部件的疲劳、失效分析 金属金
21、相学 建筑材料分析 其他方面：矿产、地质与考古、海关、造纸、电池生 产、物理学与化学、环境保护,2018年9月5日星期三,36,1.5 各种显微镜性能与特点的比较,特征,表一,2018年9月5日星期三,37,续表一,特征,2018年9月5日星期三,38,树立正确的人类认识观 DM机体器官解剖水平（宏观） LM 细胞细胞水平（微观） EM 亚细胞分子结构分子水平（超微观） EM的发展趋势 一般形态定量定性 X-ray 分析 电子衍射 俄歇电子能谱 能量分散谱仪 二维平面三维立体图象重组 静态描述动态观察 EM+计算机信息处理,2018年9月5日星期三,39,思考题,电镜和光镜有何异同？ 你知道有
22、那几类电镜？试简述各自特点及其用途。 电镜中，可否用X-ray取代电子光源？试分析其原因。,2018年9月5日星期三,40,2018年9月5日星期三,41,2018年9月5日星期三,42,2018年9月5日星期三,43,2018年9月5日星期三,44,2018年9月5日星期三,45,2018年9月5日星期三,46,2018年9月5日星期三,47,2018年9月5日星期三,48,2018年9月5日星期三,49,2018年9月5日星期三,50,2018年9月5日星期三,51,2018年9月5日星期三,52,2018年9月5日星期三,53,2018年9月5日星期三,54,2018年9月5日星期三,5
23、5,2018年9月5日星期三,56,2018年9月5日星期三,57,2018年9月5日星期三,58,2018年9月5日星期三,59,2018年9月5日星期三,60,2018年9月5日星期三,61,2018年9月5日星期三,62,2018年9月5日星期三,63,2018年9月5日星期三,64,2018年9月5日星期三,65,2018年9月5日星期三,66,2018年9月5日星期三,67,2018年9月5日星期三,68,2018年9月5日星期三,69,2018年9月5日星期三,70,2018年9月5日星期三,71,2018年9月5日星期三,72,2018年9月5日星期三,73,2018年9月5日星期三,74,2018年9月5日星期三,75,2018年9月5日星期三,76,2018年9月5日星期三,77,2018年9月5日星期三,78,2018年9月5日星期三,79,2018年9月5日星期三,80,
