1、紫外-可见分光光度法,Ultraviolet and Visible Spectrophotometry;UV-vis,分析化学系列课件,贵阳医学院药学院 分析化学教研室,第11章 紫外-可见分光光度法,紫外-可见分光光度法简介 11.1 紫外-可见吸收光谱的基本概念 11.2 紫外-可见分光光度法的基本原理 11.3 紫外-可见分光光度计 11.4 定量分析方法 11.5 定性及结构分析,（7学时),引言,紫外-可见光区的波长范围,200400nm,UV-vis的特点和应用,特点：电子光谱，强度大灵敏度高，10-710-4 g/mL准确度0.20.5%应用： 定性分析：定性鉴别、纯度检测 定
2、量分析：单组分、多组分(计算分光光度法) 结构分析：共轭体系信息,11.1 紫外-可见吸收光谱的基本概念,11.1.1 跃迁类型 11.1.2 紫外-可见吸收光谱中的常用术语 11.1.3 吸收带及其与分子结构的关系 11.1.4 影响吸收带的因素,11.1.1 跃迁类型,能在紫外光区产生吸收的有机化合物：不饱和且具有共轭系统,*,含杂原子的不饱和基团,远紫外区(max150nm),含杂原子饱和基团,饱和烃C-C单键,近紫外区,跃迁几率大，max104，强吸收,跃迁几率小， max102 ，弱吸收,C=C,（共轭）,远近紫外交界处,n*,n*,*,E,example,回主目录,分子中价电子能级
3、及跃迁示意图,成键,反键,E,轨道和轨道示意图,+,+,+,+,+,+,*,*,共轭双键的离域作用,； E,回主目录,电荷迁移跃迁,配位场跃迁,4、5周期过渡金属元素 镧系、锕系元素d轨道和f轨道分裂d-d跃迁和f-f跃迁 必须在配体的配位场作用下才能产生,几种常见的紫外-可见吸收光谱位置,*,n*,*,n*,回主目录,课堂练习, CH2=CH CH2CH2OCH3； 上述两个分子能产生哪些类型的电子跃迁？ *跃迁、 *跃迁、 n*跃迁 *跃迁、 *跃迁、 n*跃迁有哪些生色团和助色团？ 生色团：C=C；助色团：OCH3 生色团：苯环、C=O,11.1.2 紫外-可见吸收光谱中的常用术语,吸收
4、光谱的特征 生色团和助色团 红移与蓝(紫)移 增色效应和减色效应 强带和弱带,回主目录,吸收光谱(absorption spectrum)的特征,吸收峰,吸收峰,谷 ,谷 ,末端吸收(end absorption),回主目录,吸收光谱的特征,吸收峰的数目取决于分子结构中不饱和基团的种类吸收峰的位置(max)取决于电子能级差吸收峰的强弱(max)取决于电子跃迁几率,回主目录,回主目录,生色团和助色团,生色团(chromophore) ：*、n* 助色团(auxochrome) ： n*,红移(red shift) 长移(bathochromic shift),增色效应或浓色效应(hyperchr
5、omic effect),example,11.1.3 吸收带及其与分子结构的关系,E1,E2,波长较长弱吸收,强吸收,中强吸收,芳香族化合物特征吸收,300,210250,230270 重心256,max100 （弱带）,max104 （强带）,200,共轭*,n*,芳环共轭*,杂原子不饱和基团,共轭双键,芳环,回主目录,芳环的离域大键,芳环C=C骨架振动及环内*,example,B带和E带,苯的B带吸收光谱,苯蒸气,苯的乙醇溶液,苯异丙烷溶液的紫外吸收光谱,B带,E1带,E2带,苯乙酮的紫外吸收光谱,B带,R带,278,319,1100,50,B带,R带,苯乙酮的吸收带,lg,E2带,?,
6、K带,回主目录,11.1.4 影响吸收带的因素,位阻影响 跨环效应 溶剂效应 pH影响,共轭系统共平面性共轭效应 max （短移）， ,溶剂极性 K带长移，R带短移,二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱,顺式,反式,位阻影响,溶剂效应,溶剂极性,(n*),K带长移 R带短移,(*),*,非极性溶剂,极性溶剂,*,E非,n*,极性溶剂对两种跃迁能级差的影响,E极,非极性溶剂,*,n,极性溶剂,E非,E极,11.2 基本原理,11.2.1 Lambert-Beer定律 11.2.1-1 Lambert-Beer定律数学表达式 11.2.1-2 系光吸数 11.2.2 偏离Beer定律的因素,11.2.
7、1 Lambert-Beer定律,截面积S,厚度l,断层dl，含dn个吸光质点,含n个吸光质点的吸光介质,Ix,I0,I,dS=kdn,入射光强,透射光强,Lambert-Beer定律公式推导,dS/S =(kdn)/S, n = VC ，S = V/ l, n / S = l C,Lambert-Beer定律的数学表达式,-lg(I/I0)= ECl,透光率(transmitance)： T = I/I0,吸光度(absorbance)： A = -lgT,Lambert-Beer定律：当一束平行单色光垂直通过均匀的非散射吸光物质溶液时，其对光的吸光度与溶液的浓度及厚度成正比，A = ECl
8、。,定性和定量的参数,吸光系数(absorptivity),摩尔吸光系数( / EM) 百分吸光系数( ),C=1mol/L,C=1g/100ml,mol/L,g/100ml,分子结构研究,含量测定,两种吸光系数的区别,两种吸光系数的换算关系：,C=2.00mg/100ml=0.002g/100ml,A = ECl,氯霉素(M=323.15)的水溶液，用纯品配制100ml含有2.00mg的水溶液，=278nm,l=1cm,A=0.614，求 、 。,吸光系数（计算示例）,11.2.2 偏离Beer定律的因素,吸光度(A)与浓度(C)关系曲线,11.2.2-1 化学因素 11.2.2-2 光学因
9、素 11.2.2-3 透光率测量误差,11.2.2-1 化学因素,离解：,max350nm,450nm, max375nm,缔合：,溶剂化：,减免：控制一定的实验条件（稀溶液、pH范围、溶剂等）,I2,CCl4紫色 C2H5OH绿色,来源： n = VC,偏离Beer定律的因素：化学因素（图）,水溶液中Cr()两种离子的吸收曲线,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱,Cr2O72- 350nm,Cr2O72- 450nm,CrO42- 375nm,C=6.3610-6 mol/L (单体)660nm,C=1.2710-4 mol/L (二聚体)610nm,C=5.9710-4 mol/L,11.2.2
10、-2 光学因素,非单色光 杂散光(stray light) 散射光和反射光 非平行光,谱带宽度(band width,S),末端吸收处产生假吸收,溶液混浊,空白对比,实际光程l A,11.2.2-3 透光率的测量误差(T),来源：仪器噪音(noise) 性质：随机误差 种类：,暗噪音(dark noise) 散粒(讯号)噪音(signal shot noise),暗噪音与迅号噪音的误差曲线,暗噪音,迅号噪音,测量最适宜范围： A=0.20.7(或T=2065%),11.3 紫外-可见分光光度计,11.3.1 主要部件 11.3.2 常见光路类型 11.3.3 一般光学性能,11.3.1 紫外-
11、可见分光光度计的主要部件,光源：提供能量激发被测物质 单色器：将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带，获得所需单色光 吸收池：盛放溶液并提供一定吸光厚度 检测器：检测光讯号，并将光讯号转变为电讯号 讯号处理及显示器：迅号放大、数学换算,11.3.2 紫外-可见分光光度计的光路类型,单光束分光光度计,光栅,吸收池,特点：一束单色光,要求：光源稳定校零,双光束分光光度计,光栅,扇面镜,参比池,样品池,I0,I,I0,扇面镜,优点：减免光源不稳误差；改变波长不需校零； T = I/I0 缺点：不适于浑浊溶液的测定,特点：两束同波长单色光,双波长分光光度计,单色器1,单色器2,
12、样品池,A=A1-A2,1,2,特点：两束不同波长单色光,优点：无需参比；可测浑浊溶液；可得一阶导数光谱,双重单色器分光光度计,光多道二极管阵列检测器分光光度计,特点：经先后两次分光 优点：单色光较纯，杂散光降得很低(0.001%),特点：多个二极管阵列紧密排列作为检测器 优点：扫描时间极短，1/10秒内完成一张紫外-可见全光光谱,11.4 UV-vis定量分析方法,11.4.1 单组分定量分析方法 11.4.2 多组分定量分析方法 11.4.3 光电比色法,11.4.1 单组分定量分析方法,测定波长的选择原则,吸光系数要大（max） 尽可能不选末端吸收 尖峰/平坦峰 测定波长溶剂截止波长,A
13、尖,A平,11.4.1-1 吸光系数法,适用：单色光较纯，符合Beer定律 方法： 绝对法：,比较法：,UV-vis单组分定量分析方法：吸光系数法（例题）,例1:VB12 max 361nm:E1%1cm=207, A=0.414, l=1cm，求C=？,g/100ml,例2:样品VB1225.0mg1000ml， max 361nm：A=0.507， l=1cm，求VB12 (%)=?,C=25mg/1000ml=0.0025g/100ml,=20g/ml,11.4.1-2 校正/标准/工作曲线法,适用：单色光不纯，不完全符合L-B定律（曲线不过零点，线性稍差） 方法：,标准序列,固定条件,
14、AC曲线,样品,同上条件,Ax,Cx,曲线,回归方程：A=ElC=KC,Ax,校正曲线法示意图,Cx,UV-vis单组分定量分析方法：校正曲线法（例题）,例3:芦丁的含量测定:标准品(0.200mg/ml)05ml25ml样品3.0mg25ml,0.710mg/25ml,0.845,回归方程： A=0.0105+1.162C (r=0.9996),11.4.1-3 对照法（外标一点法）,适用：线性关系较好 要求：相同测定条件Cs与Cx相近 方法：,对照法示意图,As=ECsl；Ax=ECxl,UV-vis单组分定量分析方法：对照法（例题）,例4: VB12的含量测定 VB12注射液：2.50m
15、L10.00mL 对照品溶液：25.00mg 1000mL max 361nm:l=1cm,Ax= 0.508,As= 0.518,求C=?,对照法：,吸光系数法：,C=98.2mg/L,C=0.00982g/100ml=98.2mg/L,UV-vis测定一元弱酸HA的Ka,酸式体：AHA=HAC,碱式体：AA-=A-C,A=AHA+AA-=HAHA+A-A-,UV-vis测定一元弱酸HA的Ka （例题）,例5:吸光度法求VB6的pKa VB625mg100ml贮备液， l=1cm，,pH=2:酸式体,max 230375nm,pH=7:碱式体,11.4.2 多组分定量分析方法,数值计算,条件
16、：符合Beer定律、满足吸光度加合性、各组分吸收光谱有较大差异 数学模型：A=KC 方法：图解法（等吸收双波长消去法、系数倍率法）、信号处理方法、矩阵解法,两组分混合物的吸收光谱,吸收峰互不重叠,a、b互不干扰,吸收峰部分重叠,a对b干扰，b对a无干扰,1：A1a单组分定量Ca=A1a/E1al 2：A2a+b=A2a+A2b=E2aCal+E2bCbl,1：A1a单组分定量Ca=A1a/E1al 2：A2b单组分定量Cb=A2b/E2bl,11.4.2-1 等吸收双波长消去法,吸光度加和性,适用：浑浊溶液、吸收光谱重叠的混合组分 原理：双波长型分光光度计,A=A2-A1=( 21)Cl=KC
17、,干扰组分b：Ab=A1b-A2b =0 待测组分a：Aa较大,选择波长1和2的两个基本条件：,吸收峰相互重叠,a、b互有干扰,等吸收双波长消去法示意图 （消去b，测定a）,2,1,A1b=A2b,Aa,A=A1a+b-A2a+b,=A1a+A1b-A2a-A2b,=A1a-A2a =Aa =(E1a-E2a)Cal =EaCal=KCa,数学运算：,ACa,UV-vis多组分定量分析方法：等吸收双波长消去法（消a测b）,等吸收双波长消去法示意图 （消去a ，测定b ）,2,1,A1a=A2a,Ab,A=A1a+b-A2a+b =A1a+A1b-A2a-A2b,=A1b-A2b =Ab =Eb
18、Cbl=KCb,数学运算：,ACb,优点：无需空白参比，可消除本底吸收及浑浊干扰，显著提高测定灵敏度和准确度。,11.4.2-2 系数倍率法,适用：干扰组分无合适等吸收波长或不呈峰形,掩蔽系数K=A1/A2,A=KA2A1=0,优点：待测组分信号同时放大， Ax增大，提高检测灵敏度。,原理：,一般K放大57倍,系数倍率法示意图,待测组分,2,1,A1y,A2y,KA2y,A1y/A2y=K,KA2y=A1y,1：A1=A1x+A1y 2：A2=K(A2x+A2y ),干扰组分y：Ay=KA2yA1y=0,A=A2A1 =K(A2x+A2y)-(A1x+A1y)= KA2x-A1 x+(KA2y
19、-A1y),=AxCxl =(KE2x-E1 x)Cxl =KCx,干扰组分,=,ACx,11.4.2-3 导数光谱法（数学变换）,应用：定性鉴别、结构分析及痕量测定 原理： A=f()C 一阶导数光谱(A/-)： (A/)i=(Ai+1Ai)/(i+1-i) 二阶导数光谱(2A/2-)： 2A/2=(A/)/ ,导数光谱：对普通光谱原函数求导所得图象。,导数光谱的特点,零阶光谱的极大在奇数阶为0，偶数阶为极值（极大、极小交替出现）。,导数光谱的优点：突出特征，增加信息量，分辩率提高，消除杂质干扰。,零阶光谱的拐点，在奇数阶为极值，偶数阶为0。,阶数n增高，极值数目增加(n+1)，峰形尖锐，分
20、辨率增高。 高频信号随导数阶数增高而增大；低频信号（干扰组分）反之通过对吸收曲线求导，消除干扰。,极大,极大,0,0,极小,拐点,极小,极大,0,0,导数光谱的定量原理,导数光谱法对干扰吸收的消除,比尔定律：A=C(l=1cm),一阶导数：dA/d =(d/d)C 二阶导数：d2A/d2=(d2/d2)C 三阶导数：d3A/d3=(d3/d3)C ,导数信号C,A=C0+C1+C22+C33+Cnn,A=C1+C2+C32+C43+Cnn-1,微分级数消除阶次较低的背景干扰,微分,对求导,吸光系数在特定波长下的变化率,导数光谱定量数据的测量方法,采用导数光谱上适宜振幅作为定量信息,导数光谱的求
21、导,定量方法：标准对比法 求导条件：单色光的谱带宽度(狭缝宽)；波长间隔,p.峰谷法,d.基线法(正切法),z.峰零法,导数阶数：二至五阶。阶数分辩率抗干扰性S/N。奇数阶导数光谱易分辨，利于鉴别；偶数阶导数光谱易得到极值，利于测定。,导数光谱分析示例,导数光谱法检定乙醇中痕量苯,定性鉴别,定量分析,空白醇的吸收光谱,醇中含苯1ppm的吸收光谱,醇中含苯10ppm的吸收光谱,醇中含苯10ppm的二阶导数光谱,醇中含苯10ppm的四阶导数光谱,含苯胺和苯酚5ppm的吸收光谱,含苯胺和苯酚5ppm的四阶导数光谱,FNC(苯胺),DCC(苯酚),导数光谱法测定废水中 苯胺和苯酚的含量,11.4.3
22、光电比色法,显色反应的类型：配位反应、氧化还原反应、缩合反应、重氮化偶合反应 显色反应的要求 化学计量关系确定 组成恒定，化学性质稳定 选择性好(max60nm) 试剂和产物的吸收区别明显(max60nm) 灵敏度高(=103105),可见分光光度法：对能吸收可见光的有色溶液进行测定的方法。,光电比色法的显色反应条件,试剂（显色剂）：灵敏度、稳定性、选择性,用量：一般过量；影响产物组成,NH4SCN作显色剂测Fe3+： 0.01mol/L： Fe3+SCN-Fe(SCN)2+ 淡红色 0.1mol/L： Fe3+2SCN-Fe(SCN)2+ 淡血红色 0.2mol/L：Fe3+4SCN-Fe(
23、SCN)4- 血红色,溶剂,控制：条件实验(A-C),影响物质对光的吸收 显色反应产物稳定性 控制：有机溶媒可提高生成物稳定性,酸碱度,酸度过大：影响配合物离解 酸度太小：金属离子水解沉淀 不同pH范围：生成配合物颜色不同 控制：条件实验(A-pH)；缓冲溶液,时间,时间太短：反应不完全 时间太长：有色配合物再次分解 控制：条件实验(A-t),温度,影响反应速度 合适温度：促使正反应迅速完全；防止副反应发生 控制：条件实验(A-T),UV-vis定量分析方法小结,单组分定量分析方法 吸光系数法 校正曲线法 对照法 多组分定量分析方法 双波长法 导数光谱法 光电比色法,（单色光较纯）,（单色光不
24、纯）,（线性关系较好）,（等吸收双波长消去法、系数倍率法）,（显色反应条件）,UV-vis定性及结构分析,定性鉴别的一般方法（光谱比较法） 纯度检测方面的应用 有机化合物结构研究,UV-vis定性鉴别,定性鉴别的依据：,吸收峰数目 吸收峰位置max 吸收峰强弱max 吸收光谱形状,吸收光谱的特征,定性鉴别的一般方法：标准对比法,比较光谱特征数据max、 min、 sh 比较A（或max ）的比值 比较光谱一致性,对比吸收光谱特征数据,安宫黄体酮(M=386.53),炔诺酮(M=298.43),max=2401nm,max=2401nm,3,3,4,4,对比吸光度（或吸光系数）比值,适用：存在几
25、个吸收峰的样品，可消除仪器、浓度、厚度或其它原因造成的误差。,V-B12鉴别：max=278、361、550(nm) 中国药典规定：A361/A278 = 1.71.88A361/A550 = 3.153.45,对比吸收光谱的一致性,三种甾体激素的紫外吸收光谱 (10g/ml甲醇溶液）,醋酸泼尼松,醋酸氢化可的松,醋酸可的松,杂质检查,UV-vis纯度检测,吸收峰位置：化合物无吸收杂质有吸收检出 吸光系数变化：,化合物强吸收,吸收光谱变形,杂质无(弱)吸收吸光系数 杂质吸收更强吸光系数,杂质限量检测,吸光度上限值,肾上腺素与肾上腺酮的紫外吸收光谱,max=310nm,肾上腺酮,肾上腺素,峰谷吸
26、光度比值,药典规定：C=2mg/ml,l=1cm, max=310nm,A0.05,杂质,吸收峰处无(弱)吸收,吸收谷处有吸收,UV-vis结构研究简介,有机化合物的紫外吸收光谱,饱和碳氢化合物：*，短，远紫外区,不饱和脂肪族化合物,孤立双键：CH2=CH2( max=193nm) 共轭双键：CH2=CHCH=CH2(max=220nm, 104),EE,最低占有轨道,最高空轨道,跃迁几率,C=C 共轭 C=C,(*),; E,含孤立助色团和生色团的饱和有机化合物,孤立助色团： n*跃迁， 长 孤立生色团： n* (275295nm), n* (190nm), *(150180nm),、-不饱
27、和醛、酮、酸和酯,共轭C=C：K带(max=200260nm， 104)C=O：R带(max=310350nm， 100),共轭K带、R带都长移,酸、酯的K带比醛、酮长移得多 酸、酯的R带比醛、酮长移得少,芳香族化合物,苯和取代苯,苯,取代吸收带长移，B带精细结构消失,单取代苯,助色团取代： n*共轭，E带、B带 生色团取代： E带和K带合并，B带，有时被K带掩盖C=OR带极性溶剂,不同溶剂对苯酚吸收光谱的影响,环己烷,己醇,NaOH(0.1mol/L),双取代苯,各种取代基长移效应强弱次序： 邻、对位定位基：N(CH3)2NHCOCH3O-NH2OCH3 OHBr Cl CH3 间位定位基：
28、NO2CHOCOCH3COOHCOO-, CN-SO2NH2NH3+,对位二取代,200nm,381nm， =181nm52+30=82nm,265nm，只比硝基苯(252nm)长13nm,邻、对位基,间位基,252nm,=52nm,230nm,=30nm,邻、间位二取代,317.5nm 273.5nm 278.5nm,芳杂环类（五元或六元）： 饱和： 200nm 不饱和： n* 、 *,推断官能团（可能性）,有机化合物分子结构研究,220800nm无吸收峰：脂肪族饱和化合物或仅含一个双键的烯烃270350nm弱吸收：羰基 250300nm中等强度吸收，重心256nm：苯环 210250nm强
29、吸收：含有两个双键的共轭系统 260350nm强吸收：35个共轭系统 化合物有色：共轭生色团5 吸收峰延伸至可见光区：长链共轭或稠环化合物,推断构型和构象,结构异构体,松香酸,左旋松香酸,S-trans构型,S-cis构型,max(nm) 283 273 max 15100 7100,顺反异构体,maxEtOH(nm) 280 295.5 max 10500 29000,顺式： 短， 小 反式： 长， 大,位阻效应,确定构象,互变异构现象,max 247nm 310nm,max(直立键） max(平伏键）,共轭 ,推断化合物骨架,紫外吸收光谱一致：具有相同的生色团,VK1 1，4-萘醌,max
30、(nm) 249， 260，325 250，330 lg 4.28，4.26，3.28 4.6，3.8,推断化合物结构,水合氯醛可能有两种结构：,R带，290nm,UV-vis重点内容小结,掌握,基本概念：电子跃迁类型、生色团与助色团、透光率与吸光度 基本理论： 吸收带类型、特点及影响因素 Lambert-Beet定律的物理意义、数学表达式及偏离因素 吸光系数的物理意义、表达形式及其相互关系和有关计算 紫外-可见分光光度法单组分定量的各种方法,紫外-可见分光光度计的基本部件、工作原理及光路类型 紫外-可见分光光度法多组分定量方法 用紫外吸收光谱进行定性鉴别及纯度检测的各种方法,熟悉,光电比色法的原理及应用 紫外吸收光谱与有机物分子结构的关系,了解,课后练习,教材P226思考题与习题： 1、3、4、12、13、14、16,
