1、目 录题 目 2摘 要 21 文献综述 21.1 甘肃省虹鳟鱼种质资源 21.2 国内外虹鳟鱼分子水平研究进展 21.3 研究目的及意义 32 材料与方法 32.1 实验材料 32.1.1 实验样品 32.1.2 主要仪器 32.1.2 主要试剂 42.1.4 溶液配制 42.2 基因组 DNA 提取方法 52.3 基因组 DNA 检测 62.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测 62.3.2 DNA 纯度及浓度测定 63 结果与分析 63.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果 63.2 ND-1000 型分光光度计检测结果 74 讨论 915 结果 10参考文献 11摘要 13致 谢 14不同方法对鳟鱼基因组
2、DNA 提取效果的影响摘要 为虹鳟鱼遗传特征研究奠定基因组DNA提取的实验基础，本研究以虹鳟鱼肌肉组织为材料,按照常规的酚-氯仿抽提法和另外设计的一种不同方法进行基因组DNA提取并比较其效果。结果表明, 采用常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA受蛋白质污染小；而另一种未加蛋白酶K的DNA提取法由于蛋白质未被消化降解且抽提次数较少，虽提取的DNA浓度较高但蛋白质残留较为严重，这对于PCR扩增的影响较大。因此，使用蛋白酶K的常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA适于PCR扩增等后续实验研究。关键词 鳟鱼；基因组 DNA；提取；效果；比较Effects of Different Methods on
3、Extracting Genomic DNA in TroutAbstract: For genetic characteristics study lays didn genomic DNA extracted, this study experimental basis for materials, didnt muscle tissue according to conventional phenolic - chloroform extraction formulation and other design of a different methods for genomic DNA
4、extracted and compares their effect. The results showed that the conventional phenolic - chloroform extraction of genomic DNA extracted by latifah protein pollution is small; And another didnt add proteinase K DNA extraction has not been digesting degradation due to protein and extraction, although
5、fewer extracted DNA high concentration but protein relatively serious, the residual effects of for PCR bigger. Therefore, using proteinase K conventional phenolic - chloroform extraction of genomic DNA extracted for formulation of subsequent experiment research such as PCR.2Key words: trout; genomic
6、 DNA; extraction; effects; comparison1 文献综述1.1 甘肃省虹鳟鱼种质资源虹鳟(Oncorhynchus mykiss)属鲱形目、鲑科,是我国淡水养殖的主要经济鱼类。原产于美国加利福尼亚,1874年经人工迁徙驯化已在世界各地进行养殖,1959年从朝鲜移入我国黑龙江省,目前国内已有20多个省(市)开展了虹鳟养殖。甘肃是国内引进虹鳟试养(1977年)较早的省份之一，在20世纪90年代初以冷水性鱼类虹鳟的突变体为材料选育成了甘肃金鳟新品系，2007年4月被农业部列为适宜在全国具冷水资源的地区养殖的优良品种。其与目前国内外养殖的道氏虹鳟、日本金鳟相比，甘肃金鳟(
7、Oncorhynchus mykiss aguabonita)体色更艳丽，且性情温顺、生长速度快、抗病力强、个体大、耐低氧、肉质细嫩，具有很高的观赏价值和食用价值等特点，深受渔业生产者和消费者的青睐，在国内具有很强的市场竞争能力。1.2国内外虹鳟鱼分子水平研究进展随着分子生物学的快速发展，国内外对虹鳟在分子水平上也展开了多方面的研究工作。在Young等(1998)就建立了虹鳟二倍体的遗传连锁图谱 1,而后Sakamoto 等(2000)又建立了微卫星相关的精细连锁图谱 2。功能基因研究方面，虹鳟生长激素基因的cDNA于1986年被克隆并在大肠杆菌中表达 3，随后虹鳟生长激素基因的二种结构类型又
8、被发现 4。近年来，虹鳟生长激素基因的内含子与激素调节、垂体表达关系等也有研究报道 5,6；同时，利用基因型频率计算雌雄间遗传差异和亲子鉴别技术进行虹鳟鱼亲本的选择已有初步研究成果 7。在鳟鱼的遗传多样性及遗传资源研究方面，Robert (2003)和Riho 等(2007)在分子水平上对虹鳟的遗传多样性及其遗传资源评价开展了卓有成效的研究 8。在国内，张艳萍等 (2008)采用RAPD 技术,对甘肃金鳟的人工繁殖群体进行了遗传多样性研究,并和日本金鳟、道氏虹鳟的遗传结构进行了比较 9，10 。赵莹莹等（2006）利用微卫星标记3对黑龙江水产研究所的6个虹鳟养殖群体进行了研究 11，于冬梅等（
9、2008）对黑龙江引进的虹鳟养殖群体遗传结构进行了研究 12。目前在分子水平上开展遗传多样性和遗传资源评价的技术相当成熟，并在许多动植物研究中取得了显著成果。鳟鱼作为具有极高食用和观赏价值之一的物种，在分子水平上的研究相对较少，尤其是对甘肃金鳟和虹鳟鱼遗传资源的系统研究很少有报道，因此对其展开相关研究具有重要意义。1.3 研究目的及意义随着分子生物学研究的迅速发展, 基因组DNA（genomic DNA ，gDNA）的提取已成为一项常规实验,是分子遗传学实验中最常用的基本操作之一,也是最关键的一步。尽管有关提取DNA方法的报道很多,但针对不同的生物材料,一些细微的差别会影响DNA 提取的效果，
10、进而影响后续研究，如PCR扩增、限制性内切酶的酶切反应以及分子克隆、测序等实验环节。因此，根据具体研究材料，选择简便、快速、优质高效的基因组DNA提取方法尤为重要。为了获得较高质量的鳟鱼基因组DNA，为遗传多样性研究和遗传资源评价等奠定基础，本研究以常规酚-氯仿抽提法为基础，在个别步骤上设计不同处理进行甘肃鳟鱼基因组DNA 提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度计进行提取效果检测，比较不同处理的基因组DNA提取效果。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 试验样品本研究以虹鳟鱼肌肉组织为材料，来自甘肃省刘家峡养殖场。2.1.2 主要仪器MILLIQ 超纯水系统、TGL-16B 型冷冻高速离
11、心机、HH-S4 型数显恒温水浴锅、电子天平、移液枪、DYY-6C 型电泳仪、DYY-III 型 水平电泳槽、SIM-F124 制冰机、YXQ-LS-30SII 型立式压力蒸汽灭菌器、微波炉、凝胶成像分析系统（ 法国，Vilber lourmat） 、超低温冰箱、ND-1000 NanoDrop Spectrophotometer v3.3 DNA（NanoDrop Technologies, Inc） 。2.1.3 主要试剂Tris 碱（三羟甲基氨基甲烷)、SDS（十二烷基硫酸钠） 、EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 、琼脂糖、蛋白酶 K。4无水乙醇、硼酸、氢氧化钠、冰乙酸、Tris 饱和酚、氯
12、仿、异戊醇、盐酸、醋酸钠均为国产分析纯。2.1.4 溶液配制(1) 1M Tris.HCl (pH8.0):称取 60.57g Tris 溶于 400m1 双蒸水中，加浓盐酸调 pH 至8.0，定容至 500m1，高压灭菌，4保存。(2) 0.5M EDTA(pH8.0):称取 18.61g 乙二胺四乙酸二钠(Na 2EDTA. 2H2O)溶于 50m1双蒸水中，调节 pH 至 8.0，定容至 100m1，高压灭菌，4保存。 (3) 10% SDS:10g SDS 溶于 90m1 水中，加热至 68助溶，用 HCI 调 pH 值至 7.2，定容至 100mL。(4) 2M NaCI:称取 58
13、.44g NaCI 溶于 500m1 超纯水中，高压灭菌.(5) 组织样解液：1M Tris. HCl (pH8.0)25ml，0.5M EDTA 100mL、2M NaCI25ml，10%SDS50ml，加超纯水定容至 500mL。(6) 蛋白酶 K（20）mg/ml:100mg 蛋白酶 K 溶于 5 ml 灭菌双蒸水，1mL 管 EP 管分装，-20保存。(7) TE 缓冲液(pH 8.0):1M Tris-HCI (pH8.0)5mL、0.5M EDTA(pH8.0)1mL，加超纯水定容至 500mL，高压灭菌。(8) 3M NaAc(pH5.2):称取 12.305g 无水 NaAc
14、加双蒸水溶解，定容至 50m1,加冰乙酸调节 pH 至 5.2，高压灭菌。(9) 氯仿/异戊醇（24:1):将氯仿、异戊醇按 24:1 体积充分混合后装入棕色瓶中，4保存。(10) 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）:将饱和酚、氯仿、异戊醇按 25;24:1 体积充分混合后装入棕色瓶中，4保存。(11) 5TBE 缓冲液:称取 Tris 碱 54g,硼酸 27.5g，加入 20mL0.5M EDTA（pH 8.0） ，加蒸馏水溶解，定容至 1000mL，室温保存。(12) 1TBE:将 5TBE 与蒸馏水按 1:4 混合。(13) 1.0%的琼脂糖:1.0g 琼脂糖充分溶解于 100m1
15、1TBE 缓冲液中。2.2 基因组 DNA 的提取方法52.2.1 采用常规酚-氯仿抽提法，参考分子克隆试验指南 13。（1）将鱼肉组织剪碎，取大约 0.03g0.05g 装入 1.5ml 高压灭菌离心管中（注：每一样品剪完所用镊子、手术剪刀用酒精棉球擦干净，除去残留的组织；酒精挥发干净） ；（2）向各个 EP 管中加入 600L 组织裂解液，用封口膜封口后放入 55恒温水浴箱中温浴 3-4h；（3）加入 ProK（20mg/ml）溶液 10L，封口后 55水浴锅消化 12h（过夜，直到组织全部被消化） ；（4）将样品从水浴锅中取出，待冷却至室温后加入等体积约 600L的 Tris 饱和酚，将
16、样品插入泡沫板后缓慢颠倒摇晃 10min，使溶液的两相充分混匀，然后放入离心机在 412000rpm 下离心 10min；（5）用剪好的蓝枪头吸取上清到另一 1.5mlEP 管中（用剪刀将 1mL 蓝枪头剪成直径大于 3mm；吸取上清液时不要把上层那层乳白色的蛋白质吸上来，不要吸出两相界面） ；（6） 往上清液中加入 600L Tris 饱和酚，摇动混匀 10min，在 412000rpm 下离心10min；（7）吸取上层清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混匀10min（300L 酚、300L 氯仿：异戊醇） ，在 412000 rpm 下离心 10min；（8）取上清液加入
17、等体积的氯仿：异戊醇（24：1）600L，混匀 10min，在 412000rpm 下离心 10min；（9）取上清液加入 60L的 3mol/LNaAc 和-20 充分预冷无水乙醇 1000L，盖上盖子轻摇即出现乳白色丝状 DNA 沉淀浮与液体中。将样品置于冰中 15min，取出 412000rpm 下离心 10min，使 DNA 沉于管底部；（10）弃上清，加 75乙醇 1000L，混匀漂洗以除残留的盐；（11）4，12000rpm 离心 2min，弃上清，加 75乙醇 1000L混匀漂洗 DNA；（12）4，12000rpm 离心 2min，小心倒掉乙醇，将离心管倒扣与滤纸上，置于室温下
18、干燥；（13）待乙醇完全挥发，加入 200L TE 溶解 DNA，放入-20冰箱中保存。2.2.2 对比方法的 DNA 提取方法（1）将鱼肉组织剪碎，取大约 0.03g0.05g 装入 1.5ml 高压灭菌离心管中；6（2）向各个 EP 管中加入 300L 预冷 TE（防止组织块凝固，尽可能制成细胞悬液） ，3000rpm 离心 5 min；（3）弃上清，加入 1000L组织裂解液，置于 55水浴锅消化（约 3 h）至澄清；（4）取上清液，往上清液中加入 300L和 300L氯仿抽提，缓慢摇动充分混合10min，13000rpm，离心 10min；（5）取上清液于另一 EP 管中，加入 600
19、L氯仿抽提，充分混合 10min，13000rpm，离心 10min；（6）取上清液于另一 EP 管中，加入 1000L无水乙醇沉淀 DNA（轻轻摇动 EP 管，可见絮状沉淀产生） ，13000rpm，离心 8min，弃上清；（7）加入 70%乙醇 500L，混匀，12000rpm，离心 2min，弃上清；（8）将 EP 管倒置于干燥滤纸上，干燥后加入 100L TE 溶解，放入-20冰箱中保存。2.3 基因组 DNA 检测2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测取 3ul DNA 提取样品与 0.5ul 6Buffer 上样缓冲液混匀，加样于 1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，100V 电压下电泳 20 m
20、in 于紫外灯下观察结果，并拍照。2.3.2 基因组 DNA 纯度及浓度检测基因组 DNA 浓度及纯度的检测委托甘肃农业大学检测中心实验室工作人员完成。3 结果与分析3.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果 提取的基因组 DNA 用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图 1。由图可见，对比方法提取的基因组 DNA 条带最亮，说明其浓度最高，酚-氯仿抽提法提取的基因组 DNA相对对比方法条带较暗，说明其浓度较低。但从基因组 DNA 目的条带下方的拖带情况来看，同时能够说明酚-氯仿提取的基因组 DNA 降解程度非常低，对比方法提取的基因组DNA 降解最为严重。7图 1.基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测
21、结果3.2 ND-1000 型分光光度计检测结果ND-1000 型分光光度计测定鳟鱼基因组 DNA 的 A260/A280值及浓度见表 2。A 260/A280指基因组 DNA 溶液在波长 260nm 与 280nm 处的光吸收值的比值，该值可以反映基因组DNA表 2 基因组 DNA 的 A260/A280值及浓度测定结果A260/A280 浓度（ng/L）样品名称 酚-氯仿 对比方法 酚-氯仿 对比方法H1 2.00 1.72 39.43 72.23H2 2.45 1.72 13.62 91.32H3 2.14 1.68 45.15 80.71H4 2.08 2.05 58.47 132.2
22、6H5 2.06 1.81 67.80 162.92H6 2.12 1.97 46.59 112.30H7 2.01 1.72 51.48 126.84H8 2.11 1.86 61.17 108.50H9 2.00 1.88 29.13 98.66H10 2.32 1.96 42.62 84.71H11 2.16 2.00 55.31 105.64H12 2.05 2.00 32.15 132.57H13 2.13 1.73 24.98 151.49H14 2.34 1.86 47.53 117.60H15 2.24 1.93 60.43 88.64H16 2.28 1.96 59.68 1
23、10.568H17 2.08 2.05 41.49 94.61H18 2.06 2.03 50.36 138.56H19 2.17 1.84 47.70 121.05H20 2.26 1.94 19.80 99.16H21 2.30 1.92 51.67 128.46H22 2.22 1.72 67.11 114.67H23 2.04 1.80 39.41 91.16H24 2.08 1.98 55.17 87.84H25 2.10 1.90 45.12 138.18H26 2.04 1.86 23.75 116.94H27 2.32 1.73 34.18 111.73H28 2.20 1.9
24、7 60.81 106.15H29 2.18 2.01 27.16 98.16溶液的纯度。由表可以看出，酚-氯仿抽提法基因组 DNA 的 A260/A280值均在 2.0 以上，对比方法的 A260/A280值在 1.68 与 2.05 之间，对比方法提取的基因组 DNA 浓度最高，而酚-氯仿抽提法提取的基因组 DNA 浓度稍低。采用 ND-1000 型分光光度计检测基因组 DNA 的光吸收峰见图 2。由图可见，酚-氯仿抽提法提取的基因组 DNA 最高吸收峰出现在 260nm 的波长处，而核酸的最大吸收波长正好是 260nm，说明得到的 DNA 溶液纯度较好，受杂质影响较小；对比方法在 260
25、nm 处没有较为理想的光吸收峰。图 2-1 酚-氯仿抽提法的基因组 DNA 光吸收峰9图 2-2 对比方法的基因组 DNA 光吸收峰4 讨论提取动物基因组 DNA 的方法较多，大致有以下几种：酚-氯仿法、试剂盒法、甲酰胺法、缠绕 DNA 法等。但各方法中最为关键的一点是消除蛋白质、RNA 以及提取过程中试剂残留物等杂质污染，同时也尽可能降低 DNA 降解程度。如果提取的 DNA 中含上述物质的污染，将直接影响后续 PCR 扩增等实验环节 14，15 ，因此 DNA 的纯化程度对后续实验的成功与否起着关键性的作用。酚-氯仿法提取基因组 DNA 通常是采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理样品。S
26、DS 能溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，而使细胞膜被破坏，解离细胞中的核蛋白；蛋白酶 K 能水解消化白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，蛋白质被消化降解后与其他细胞组分一同被酚和氯仿等有机溶剂抽提出来，再用醋酸钠沉淀，最后经乙醇洗涤得到较高质量的 DNA。酚-氯仿抽提法是提取动物基因组DNA 最常用的方法。提取动物基因组DNA 一般常用以下组织:鳍条、毛发、血液、肝、肾和肌肉等。本研究以肌肉组织为材料进行DNA提取，其取材容易,易于剪碎、消化, 操作简单。本研究提取的 DNA 经琼脂糖凝胶电泳检测发现,对比方法的 DNA 条带最亮，其原因主要是在 DNA 提取过程中未加 Tris 饱和酚，抽提次
27、数少，DNA 损失小，浓度高，故条带亮。但对比方法的 DNA 有拖带现象，可能是降解的 DNA 或是 RNA。酚-氯仿抽提法提取的 DNA 条带清晰，没有拖带现象，但比起对比方法的条带较暗，因为 DNA 提取时抽提的次数较方法 2 多了两次，DNA 损失大，浓度低。核酸具有紫外吸收特性，一般最大吸收波长为 260nm。DNA 的纯度通过 A260/A280反10应出来，一般来说，该值在 1.8 左右，说明 DNA 溶液受蛋白质、RNA 和其他有机质等小分子物质污染较小；比值高于 1.8 说明有 RNA 及小分子物质存在；低于 1.8，说明有蛋白质和酚等物质污染，尤其是 270nm 为最高峰吸收
28、时 16。唐恩洁等（1997）认为用于PCR 扩增模板的A 260/A280 的比值应大于1.8 (DNA )或2.0(RNA) ,方能获得良好的PCR扩增结果 17。谢友菊等（1990）研究发现质量较好的DNA其 A260/A280值应在1.72.0之间，若大于2.0 则说明RNA尚未除净，小于1.7则说明样品有蛋白或酚 18。李明云等(2002)用试剂盒法提取的大黄鱼基因组DNA的A 260/A280值在1.751.90之间 19。刘臻等(2004)利用酚-氯仿法提取的鲫鱼基因组DNA的A 260/A280值在1.661.87之间 20。从DNA的A 260/A280值和DNA 光吸收峰来
29、看，本研究方法1的基因组DNA A260/A280值均在2.0以上，且DNA最高吸收峰在 260nm处，分析其原因主要是由于组织中蛋白质被蛋白酶K消化后而被抽提出来，而对其中的 RNA未作降解处理，其中存在一定的RNA 。方法2 DNA的A 260/A280值在1.682.05 之间，且没有形成理想的光吸收峰，提取效果不稳定，原因是DNA提取操作过程中抽提次数较少且未用蛋白酶K处理，DNA中蛋白质和酚等杂质较多。方法3提取的基因组DNA A260/A280值处于1.691.83之间，光吸收最高峰在270nm波长处，可能也是因为蛋白质抽提不彻底。从以上分析来看，方法1提取的基因组DNA蛋白质含量
30、低而RNA 含量高，方法2和方法3 提取的DNA蛋白质和RNA的含量都比较高，由于蛋白质对 PCR扩增的影响较大而RNA易降解对PCR扩增影响不大，因此，方法1提取的基因组DNA质量好，适于PCR扩增等后续实验研究。5 结论采用常规酚-氯仿抽提法由于蛋白酶K的作用在提取的基因组 DNA中蛋白质污染较小，而在不加蛋白酶K的提取方法中由于蛋白质残留较为严重， 但由于抽提次数较少，提取的DNA浓度较高。由于蛋白质对PCR扩增的影响较大而RNA易降解对PCR扩增影响不大，因此，使用蛋白酶K的常规酚-氯仿抽提法提取的基因组 DNA质量好，更适于PCR扩增等后续实验研究。11参考文献1 Young WP,
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