1、HIV TAT 蛋白研究进展(1)【关键词】 人免疫缺陷病毒反式激活蛋白蛋白转导药物治疗人类免疫缺陷病毒1 型基因能够编码一种被称为反式转录激活因子的蛋白。它通过与反式激活应答 RNA 序列结合以起始基因转录。TAT 蛋白和 REV 蛋白一起作为HIV1 的调控因子，在 HIV 的基因表达中起着举足轻重的作用。研究发现，TAT 蛋白能够穿过细胞膜1,2 ，到达细胞外，具有细胞膜穿透肽活性，其穿膜序列由 11 个氨基酸组成。这一特性具有非常重要的应用价值，因为它提供了一条转运其他蛋白或药物穿过细胞膜，进入细胞的途径。通过设计编码穿膜序列和其他蛋白的融合基因，表达后获得的融合蛋白，在 TAT 的引
2、领下可以进入细胞。本文就 TAT 蛋白的生物学作用及其近年来的研究进展作一综述。1 TAT 蛋白结构TAT 蛋白的基因包含 2 个外显子和一个含 2334 个核苷酸的内含子组成。在 HIV1 的各亚型中，TAT 蛋白的氨基酸组成有所不同。在 HIV1 中，TAT 蛋白由 86 个氨基酸组成；而在 HIV1 中，TAT 蛋白由 101 个氨基酸组成。按照结构和功能的不同可以将 TAT 蛋白划分为 5 个区：酸性 N 末端区；半胱氨酸富积区，含有 7 个 Cys，这在HIV 各亚型中高度保守；核心区，含有 RKGLGI 基序；基本区，具有 RKKRRQRRR 基序，并且具有 TARRNA 结合活性
3、；细胞黏附的 C-末端区，含有 RGD 基序，TAT 通过 RGD 基序与细胞整合素结合。Vive 等3发现，TAT 蛋白中具有穿膜功能的序列是位于 4757 的 11 个氨基酸，富含碱性氨基酸，被称为蛋白转导域。为了更好地了解 TAT 蛋白的功能，加拿大Manitoba 大学的 Shojania 等4采用 15N 和 13C 标记TAT 蛋白，并通过核磁共振对其结构进行了分析。此富含半胱氨酸的蛋白在时被还原，NMR 化学位移和耦合常数表明它是以无规则卷曲的形式存在，半胱氨酸富含区和核心区的谱线增宽并出现多峰，提示有的结构域出现了瞬时折叠。通过 NMR 弛豫参量，光谱密度和 LipariSza
4、bo 方法进行的分析都表明整个分子中没有特定的结构，是一种天然未折叠蛋白。这与它能跟多种蛋白及核酸相互作用的功能相一致。2 TAT 蛋白在 HIV 引起的疾病中的作用TAT 蛋白作为一个反式激活作用因子，在 HIV1 基因复制过程中起重要作用，其基本区和核心区在反式激活作用中起关键作用。TAT 蛋白还可以在转录水平上调节宿主细胞的功能，它还能表现出许多生物学活性：诱导血管形成，单核细胞的趋化性及炎症细胞因子如 IL1 ，IL6 和TNF 等的分泌。TAT 蛋白还可以促进来源于单核细胞的树突状细胞成熟，增强其功能和抗原特异性 T 细胞反应。此外，TAT 蛋白还有其他重要的生物学功能，艾滋病患者常
5、伴发其他疾病，如卡波济肉瘤、神经疾病等，可能与 TAT蛋白有关。TAT 蛋白加快卡波济肉瘤的发病过程卡波济肉瘤是由卡波济肉瘤相关疱疹病毒引起的。在艾滋病流行以前，KS 主要见于意大利人和犹太人的老年男性中，而且肿瘤生长缓慢。而在艾滋病患者中，肿瘤生长迅速，并扩展到肺、胃肠道及其他器官中。研究表明，TAT 蛋白是卡波济肉瘤发病过程中的一个重要因子。TAT 蛋白与感染有 KSHV 的 BCBL1 细胞系共培养，发现 TAT 蛋白可以诱导 KSHV 基因转录产生裂解期 mRNA并表达产生蛋白质。表明 TAT 蛋白通过诱导 KSHV 复制，增加 KSHV 病毒数量来参与 KS 发病过程5 。TAT 蛋
6、白的神经毒性TAT 蛋白与 HIV1 引发的神经损伤有关，表现出神经毒性。TAT 蛋白与甲基苯丙胺协同作用可以使纹状体多巴胺能神经末梢变性，使多巴胺和多巴胺转运蛋白减少，引起基底神经节结构的损伤，TNF 参与这一过程6 。Aprea 等7对 TAT 引起的神经元损伤和细胞死亡的分子机制进行了研究。TAT 蛋白与大鼠胚胎皮质神经元作用后，可以引起微管相关蛋白 2 快速降解及细胞骨架微丝的塌陷。这与观察到的神经机能异常的 AIDS 患者脑内 MAP2缺失以及神经元损伤一致。基质金属蛋白酶是一类结构相似、含锌的内肽酶，可以降解胞外基质蛋白，也能破坏血脑屏障和神经突触。它可以降解 TAT 蛋白，调节其
7、神经毒性和转录活性8 。TAT 蛋白、MMP 与人胎儿神经元共孵育后，通过测定线粒体膜电势的变化及神经元死亡情况，发现神经毒性显著降低。而 MMP 抑制剂可以阻断这一效果。细胞中 MMP 对 TAT 蛋白的水解作用，被认为是宿主的一种独特的先天性免疫机制。HIV 感染患者脑部出现淀粉样沉积物，脑啡肽酶是脑部淀粉样肽链主要的降解酶。Daily 等9发现源自 TAT的多肽可以抑制脑啡肽酶，使之失活，从而出现淀粉样沉淀物。研究表明 TAT 蛋白本身并不能抑制脑啡肽酶，起作用的是来自其半胱氨酸富含区的多肽。TAT 蛋白表现出神经毒性的机制可能包括与整合素受体结合，诱导氧化应力，造成线粒体损伤，启动炎症
8、级联反应10 。也有研究表明，TAT 蛋白可以与星形胶质细胞、小胶质细胞及脑水皮细胞作用增加诱导型 NOS 的表达，释放 NO11 。TAT 蛋白与家族性原发性肺动脉高压家族性原发性肺动脉高压与上皮细胞和巨噬细胞表面的骨形态发生蛋白受体2 基因突变相关。BMPR2 是介导骨形态发生蛋白信号的受体，属于转化生长因子 受体（transforminggrowthfactorreceptor ，TGFR) 家族成员。在 FPPH 患者中发现，TAT 蛋白能够抑制巨噬细胞的基因转录。将 BMPR2 启动子转染进入巨噬细胞系 U937，观察TAT 蛋白对其表达的影响。结果表明 TAT 蛋白可以下调BMPR
9、2 的表达并抑制其功能12 ，TAT 蛋白定位在 BMPR2启动子的起始208bp 上。TAT 蛋白可能是 FPPH 的一个致病因子。TAT 蛋白引起的免疫应答Kittiworakarn 等13发现 TAT 蛋白可以作为自佐剂而引起免疫应答。他们合成了一系列的 TAT101 系列物，发现在 BALB/c 小鼠中可以诱导抗体反应，在 SWISS 杂种小鼠体内也发现抗 TAT 抗体反应，这表明这种自佐剂现象并不局限于特定的遗传背景。此外，体外注射 TAT101 系列物还能得到能够分泌 IL2 的特异 Th 细胞。这些现象表明TAT101 在没有佐剂的情况下，能够引发小鼠体液免疫反应。进一步研究发现
10、，控制自佐剂现象的核心区域位于氨基末端区以及半胱氨酸富集区。引发这种抗体反应的主要分子事件是半胱氨酸介导的寡聚化，Cys34 残基的氧化形成的TAT 二聚体可以使抗体反应增强。3 TAT 蛋白穿膜序列的应用TAT 蛋白具有穿膜功能，其 PTD 能够与其他大分子物质，如蛋白等一起穿膜进入细胞。利用这一性质可以将体内不能正常合成的蛋白酶通过这一途径转导进入细胞，使之发挥生物学作用。Delom 等14首次发现 TAT 蛋白能够转导外源蛋白进入秀丽隐杆线虫的肠上皮细胞。这说明 PTD的跨膜功能不具有物种特异性。近几年来，TAT 蛋白的 PTD受到越来越广泛的重视，许多科学家都在利用其穿膜功能从事相关研
11、究。国外在 TAT 穿膜序列应用方面的进展链霉亲合素是一个四聚体蛋白质，能够与生物素特异结合。将其与 TAT 蛋白融合，得到融合蛋白 TATSA ，用来转运生物素化的药物或其他物质进入细胞。Albarran 等15用生物素化的碱性磷酸酶与 TATSA 结合后，通过荧光激活细胞分选分析和共聚焦显微镜鉴定表明碱性磷酸酶在 TAT 介导下进入到了细胞内，而且保持了原有的生物学活性。同时发现，融合蛋白进入细胞是通过内化作用，即静电介导的细胞表面吸附，然后形成囊泡，进入细胞。这为分子转运进入细胞提供了一条新途径，可以使之生物素化，然后通过与 TATSA 结合进入细胞，将来可能会有更大的应用。米屋西林是
12、GLC1A 基因的表达产物，是一种酸性蛋白，分布于睫状体长足细胞和基底细胞，与光感受器细胞的纤毛相连。它属于细胞骨架蛋白，参与纤毛样神经上皮的形态发生。米屋西林与青少年原发性开角青光眼的发病相关，在许多青光眼患者中都发现该基因突变。Sakai 等16实验表达了带血细胞凝集素标签的 TAT 与米屋西林的融合蛋白 TATHAmyocilin ，并将其转导进入人及牛的小梁网中。通过体外细胞培养、组织培养和器官培养发现，TATHAmyocilin 可以进入小梁网细胞、小梁组织及牛眼中。通过 TAT 蛋白介导米屋西林进入小梁网组织中，可以进一步研究该蛋白在青光眼的发病过程中的作用。嘌呤核苷磷酸化酶（pu
13、rinenucleosidephosphorylase，PNP)功能受损会引起核苷酸稳态失衡、T 细胞免疫严重缺陷及神经机能损伤和神经细胞死亡。对于 PNP 缺陷病，现在还没有有效的治疗措施。PNP 是一个细胞内酶，将外源 PNP 转运进入细胞内不失为一个好的治疗办法。Toro 等17融合了 TAT 蛋白与PNP，得到 TATPNP。将其注射到 PNP 缺陷型小鼠体内后，观察长期活性的变化。TATPNP 可以进入各种组织，包括脑，而且能够免受抗体中和，不会通过尿液排泄，在体内表现出很好的生物学活性。24 周后，还能表现出生物学活性。多次注射可以校正代谢不良及免疫缺陷，没有表现出明显的毒性。这些
14、结果进一步证明，TAT 蛋白可以作为载体介导药物进入细胞内用于治疗一些疾病。Tara 等18将 PTD 与抗细胞死亡蛋白（FNK）重组并转导进入骨髓单核细胞中，观察其是否会抑制细胞死亡并提高将其移植到缺血区的效率。实验结果表明，转导有PTDFNK 的骨髓单核细胞可以更好地存活并保持分化为内皮祖细胞（endothelialprogenitorcell，EPC）的潜能。当将表达 EGFP 的骨髓单核细胞移植到大鼠的缺血区后发现，用 PTDFNK 处理的骨髓单核细胞能够更有效地整合到血管中，还保持着生成血管的潜能。PTDFNK 可以显著地提高骨髓单核细胞移植到缺血区的效率。（作者：未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
