1、HeLa细胞中 HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒 VSV复制的影响(1)作者：廖继佩，薛小平，尹文，雷迎峰，吕欣，杨敬，徐志凯【关键词】丙型肝炎病毒EffectofHCVNS5AexpressioninHeLacellsoninterferonsensitivevirusVSVreplication【Abstract】AIM:TodemonstratetheeffectofHCVNS5Aexpressiononvesicularstomatitisvirus（VSV）replication.METHODS:Stablytransfectedcellswereculturedperwell
2、ina6welltissuecultureplateandculturedfor24h.HumanrecombinantIFN2awasthenaddedatvariousconcentrationsfor24htoinducetheIFNantiviralstate.InfectionwithVSVwasthenperformedandsupernatantswereharvestedatvarioustimepointsafterinfection.Changesininfectiousvirusyieldsweremeasuredbyastandardvirusplaqueassayin
3、Verocells.RESULTS:WhentheIFNconcentrationwas1105U/L,HeLaNS5AcellsinfectedwithVSVhadmoreobviouscytopathiceffectcomparedwiththatofHeLaNS5AISDRcells.InthevariousconcentrationtreatmentsofIFN,thevirustitersinthesupernatantofHeLaNS5Acellswereabout2to5timesthoseofHeLaNS5AISDRcells.CONCLUSION:NS5Aexpression
4、rescuesVSVreplicationduringIFNtreatmentandthiseffectisdependentontheputativeinterferonsensitivitydeterminingregion.ThiseffectwillbehelpfultodemonstratethatHCVcannaturallyevadetheIFNinducedantiviralresponseinpersistentlyinfectedpatients.【Keywords】hepatitisCvirus;nonstructuralprotein5A;interferonsensi
5、tivitydeterminingregion;vesicularstomatitisvirus;plaqueformingunit【摘要】目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）NS5A 的表达对水泡性口炎病毒复制的影响.方法：将稳定转染的HeLaNS5A和 HeLaNS5AISDR 细胞在 6孔培养板中培养 24h后，加入人基因工程 2a 型干扰素至所需浓度.培养 24h后加入 VSV，继续培养相应时间.取培养上清液，按 10-1稀释，50L 稀释液加入含 Vero细胞的 24孔培养板中.每孔加入含 100mL/L小牛血清的 g/L羧甲基纤维素钠 1mL.继续培养 48h后移走培养液，结晶紫染色，
6、自来水轻柔洗净，记录噬斑形成单位.结果：干扰素浓度为 1105U/L，VSV对 HeLaNS5A细胞的致病变作用要比对 HeLaNS5AISDR 细胞的致病作用更明显.在整个 IFN浓度处理中，HeLaNS5A 细胞培养液中的病毒滴度是 HeLaNS5AISDR 细胞培养液中的病毒滴度的 25倍.结论：NS5A 能增强 IFN敏感病毒的复制，HCVNS5A内的 ISDR可能是造成 IFN对 HCV患者治疗效果的因素.【关键词】丙型肝炎病毒;非结构蛋白 5A;干扰素敏感决定区;水泡性口炎病毒;空斑形成单位0 引言干扰素是目前治疗丙型肝炎最有效的药物，但治愈率不到 30%.有人认为，NS5A 内存
7、在干扰素敏感决定区，影响IFN的抗病毒疗效.在临床研究中，丙型肝炎病毒 NS5A对IFN抗病毒治疗具有固有抗性的观点仍有争论.NS5A 可利用所谓的 ISDR外的序列来干扰或逃避 IFN诱导的抗病毒效应,宿主介导的压力选择主要作用在 NS5A的 C端1 ，但是Mangoni等2认为 ISDR的上游变异性与 IFN治疗应答有关.另外，NS5A 可能与 2,5寡腺苷酸合成酶相互作用，以 ISDR非依赖机制抑制 IFN的抗病毒活性3.为了进一步探明 HCVNS5A中是否存在影响 IFN治疗的结构域，在已经成功构建的稳定转染 HeLaNS5A和 HeLaNS5AISDR 细胞系的基础上，我们利用对 I
8、FN敏感的病毒水泡性口炎病毒，在 IFN存在的条件下通过对比分析 VSV在这两株细胞系中复制的差异，探讨 HCVNS5AISDR与 IFN疗效的相关性.1 材料和方法材料稳定转染的 HeLaNS5A和 HeLaNS5AISDR 细胞系由第四军医大学基础部微生物学教研室构建;VSV 病毒由第四军医大学生物技术中心提供;Vero 细胞由本室保存;胰蛋白酶购于宝生物工程有限公司;DMEM 和 HEPES购自 Invitrogen公司;结晶紫购自湖南化学试剂公司;羧甲基纤维素钠购自天津市科密化学试剂开发中心;小牛血清购于中美合资兰州民海生物工程有限公司;人基因工程 2a 型干扰素购自第四军医大学生物技
9、术中心.方法称取 gCMC，溶于 100mL三蒸水中，高压灭菌.将配好的100mL2DMEM移入盛有 100mL15g/LCMC的玻璃瓶中混匀，然后加入 22mL小牛血清，此即为含 100mg/L小牛血清的g/LCMC溶液.称取 5g结晶紫，溶于 100mL无水乙醇，此即为 50g/L结晶紫贮存液.待使用时移取 50g/L结晶紫贮存液8mL，g/LNaCl30mL，甲醛 2mL，混匀后即为 10g/L结晶紫染色液.将 IFN加入培养上清液至终浓度为 1105U/L，培养24h后，按感染复数=1 加入相应体积的 VSV病毒贮存液.继续培养 36h后在倒置显微镜下观察 VSV对稳定转染的HeLaN
10、S5A和 HeLaNS5AISDR 细胞形态的影响.在 6孔培养板中每孔加入稳定转染的 HeLaNS5A和 HeLaNS5AISDR 细胞 5105个.培养 24h后，加入 rHuIFN2a.培养 24h后按MOI=1加入 VSV，继续培养 24h和 36h.取培养上清液稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，取 50L稀释液加入 24孔培养板中，每一处理均做 3个平行孔.其中，24 孔培养板中每孔已加入 5104个 Vero细胞，并已培养了 24h.将 24孔培养板中放入 37,50mL/LCO2 的孵箱中以利于 VSV吸附在 Vero细胞上，平衡吸附 1
11、h后，将上层液移走，每孔加入 100mL/L小牛血清 g/LCMC1mL.继续培养 48h.将 24孔培养板中的培养液小心移走，PBS 洗 2次，10g/L结晶紫染色 20min，弃染色液，用自来水轻柔洗净，颜色较浅或白色的即为 PFU，记录 PFU值.在 6孔培养板中加入 HeLaNS5A和 HeLaNS5AISDR 细胞 5105个，每一种细胞各 3孔.在 37/50mL/LCO2 的孵箱中培养 24h后，每一孔中加入 IFN至终浓度为 105U/L，再继续培养 24h后，按 MOI为，1 和 10加入 VSV，继续培养 48h，然后按中的方法测定 PFU值.（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
