1、动物组织的提取与鉴定,陈 彦,安徽大学生命科学学院,生物科学和生物工程专业 生化与分子生物学实验,实验1、Sephadex-G50分离蛋白质 实验2、动物基因组的制备及其鉴定 实验3、糖类化合物的提取及分析 实验4、蛋白质的FPLC分离与定量测定 实验5、质粒DNA的小量制备 实验6、质粒DNA的酶切及电泳鉴定 实验7、大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化 实验8、聚合酶链式反应技术 实验9、DNA的体外重组,分离纯化核酸原则与要求,1.应保证核酸一级结构的完整性完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求) 2.排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制
2、作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其他核酸分子的污染，例如提取DNA分子时，应去除RNA分子 3.减少化学因素对核酸的降解避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH 410条件下进行,4. 减少物理因素对核酸的降解强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些 。5. 防止核酸的生物降解细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。DNA酶需要Mg2+，Ca2+的激活，因此实验中常
3、利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性RNA酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮或一70的冰箱中。,DNA在细胞内的分布,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。 真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子； 95的真核生物DNA主要存在于细胞核内,其他5为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等,DNA的性质,
4、DNA是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积力而进一步加强，使DNA在细胞内比其他成分更具化学耐久性。 因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，DNA分子仍然稳定。真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白(组蛋白)结合而成核蛋白(DNP)形式而存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液(1-2mol/L 氯化钠)，但不溶于生理盐溶液中(0.14mol/L 氯化钠)，而RNP此时的溶解度较大，因此可利用这一性质，将DNP与RNP分离。DNA在乙醇中形成絮状沉淀，使DNA最终得以分离,真核生物基因组DNA分离纯化的基本步骤,真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都
5、可以用来制备基因组DNA。提取方法包括两步：,1、先温和裂解细胞及溶解DNP，而后使DNP与RNP分离，再使核蛋白解离，释放出DNA.真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子质量的DNA，一般多采用后者温和裂解细胞。,高分子质量DNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而弯曲的DNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸基团间的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNA容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，大于150 kb的DNA分子在常规分离方法中多
6、被切断。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得小于200 kb的DNA片段。,2. 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子,猪脾脏DNA提取与鉴定,【实验目的】掌握浓盐法提取与鉴定动物组织DNA的原理和方法。,【实验原理】,核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。在细胞内，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNP），DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DNP）。 在.14 molL的氯化钠溶液中， RNP的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的
7、1；当氯化钠的浓度达到1 molL的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常选用.14 molL的氯化钠溶液提取RNP ，而选用1 molL的氯化钠溶液提取DNP 。,核酸提取液中含有的蛋白质、多糖等可以用沉淀分离法除去。在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。,核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使DNA或RNA呈絮状沉淀析出。,【实验材料】,1材料 新鲜(冰冻)猪脾脏。 2器材 高速组织捣碎机，恒温水浴，台式冷冻离心机，锥形瓶，具塞三角瓶，试管
8、3试剂 (1) 0.1mol/L NaCI-0.05 mol/L柠檬酸钠混合液：称取0.58g NaCl和1.47g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后稀释至100mL。 (2) 10(1.71mol/L)NaCl溶液 (3) 氯仿:异戊醇(24:l ,V/V)，现用现配。 (4) 95乙醇,【实验方法】,1取新鲜(冰冻)猪脾脏20g，剔去结缔组织，用0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸溶液冲洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。2加入2倍组织重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠混合液(40mL)置高速组织捣碎机内破碎细胞膜(慢档，每次5s，间隔30s，共绞3次)，获得组织
9、浆液。3组织浆液于3000r/min离心15min，弃去上层液，收集沉淀(包括细胞核)。4向细胞核沉淀中加入6倍组织重的10(1.71mol/L)NaCl溶液120mL，充分搅匀，置冰箱内过夜。,【实验方法】,5次日将所得到的半透明粘稠状液体连续注入预冷的11倍体积(1320mL)蒸馏水中，轻轻摇匀，DNP即呈絮状沉淀析出，置冰箱内放置数小时。6上层清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少量溶液经离心(3000r/min，15min)，收集DNP沉淀。7将DNP沉淀再溶于原组织重约4倍体积(80mL)的10NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解。,8加入l/2体积的氯仿-异戊醇溶液(24:l ,V/V
10、) 40mL，上下剧烈振荡10min，使组蛋白分离，于3000r/min，离心l5min，吸出上面含有DNA和DNP的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。9上层水相再次加入20mL氯仿-异戊醇混合液，继续抽提去除蛋白，多次重复此操作直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。,【实验方法】,10最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷至4的95乙醇中。 11用玻棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80和95乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。,【实验方法】,【注意事项】,1为了防止大
11、分子核酸在提取过程中被降解，使其分子断裂，因而不能获得天然的大分子核酸。提取中需要加人柠檬酸钠、EDTA、8-羟基喹啉等抑制核酸酶的活力，并在低温下进行操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，强碱和剧烈振荡等。本实验第一步进行组织匀浆时，不宜过于剧烈，时间不能太长，避免部分细胞核被破坏，导致DNA释放而被断裂，这将关系到最后是否能获得纤维状DNA。,2除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分DNA断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状DNA外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的DNA。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响DNA制品的质量。3细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，有时可能形成块
12、状凝胶(如以脾脏为材料制备DNA)，应置捣碎机内绞5s，打碎凝胶块，但此时DNA已从核内溶解出来，因此不宜剧烈打碎。,【注意事项】,思考题,1.为什么在低温下进行？ 2.加柠檬酸钠和EDTA的作用 ? 3.加NaCl的作用，为什么要加到1mol/L? 4.加入异戊醇有什么作用？,二苯胺显色法测定DNA含量（一）,强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400g范围内光密度与DNA浓度成正比。,【实验原理】,在反应液
13、中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。,、二苯胺试剂：1g二苯胺 （需在70%乙醇试剂中重结晶2次) +100 mL冰乙酸+10mL过氯酸(60%以上)，混合待用，临用前加入1.0 mL1.6%乙醛。每组需64ml、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）准确称取小牛胸腺的DNA 钠盐，以0.01mol/L NaOH 溶液配成200g/mL 的溶液。 每组需14ml、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。共
14、需70ml 、待测样品液：准确称取干燥的DNA 制品2-5mg,以0.01mol/L NaOH 溶液配成100-150g/mL 的溶液 。每组需6ml,1. DNA标准曲线的制定：取10支试管，分成2组，依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于沸水浴中加热10min ，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。,【操作方法】,DNA标准曲线的制定,2. 制品的测定： 取2支试管，各加2ml待测液（
15、内含DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。 3. 根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。,【操作方法】,DNA纯度：待测液中测得的DNA微克数DNA%= 100 待测液中样品的微克数DNA产率:测得的DNA的微克数DNA%= 100 原料的微克数,数据处理,二苯胺试剂仅能与嘌呤核苷酸中的脱氧核糖反应. 因此测定的可靠性受到不同来源的DNA中嘌呤与嘧啶核苷酸比例变化的限制，为提高测定准确度，应使用经纯化的其含磷量已知的小牛胸腺DNA作为标准样品进行校正。 二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色
16、不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。,【注意事项】,【实验结果讨论】 1该反应灵敏度较低，但方法简便，目前仍广泛使用。 2其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对此反应由干扰，测定前应尽量除去。,紫外吸收法测定DNA纯度（二）,核酸在260nm波长处具有紫外吸收特性(最大吸收峰)。此法快速、简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高的纯DNA和RNA溶液的首选方法。高纯度DNA制品的260nm与280nm的吸光值在1.8左右，当比值偏高时表明制品中混杂有RNA,而比值偏低时则表明制品中可能有蛋白质或酚的污染。因此，可利用A260/A280比值的测定来鉴定DNA制品的
17、纯度。,【实验原理】,1吸取50-150微克/毫升DNA样品，加0.01mol/L NaOH(或ddH2O) lmL混匀至5-50微克/毫升，转入石英比色杯中(若样品很少，可用0.5mL的比色杯，上述体积均减一半)。 2用1mL水校正紫外分光光度计的零点。 3在260nm，280nm处分别读出吸光度值(A)。 定量分析：DNA的浓度=A260核酸稀释倍数501000=A260(10005)501000=10A260(g/l)RNA的浓度=A260核酸稀释倍数401000=A260(10004)401000=10A260(g/l),【实验步骤】,分光光度换算： 1A260双链DNA=50g/ml
18、 1A260单链DNA=30g/ml 1A260单链RNA=40g/ml,4纯度分析：若为DNA纯品，则A260A280=1.8若为RNA纯品，则A260A280=2.0若DNA样品A260A2801.8，说明仍有RNA，可用RNA酶处理样品；若A260A280l.7，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化DNA。若为RNA样品A260A2802.0，也应考虑再用酚/氯仿抽提。若核酸样品A260A2302.0，考虑有盐未除尽。用A260A280比值估计核酸纯度仅在制备物中没有酚时才准确，因水饱和酚在270nm波长处有特征性吸收峰，其A260A280比值也为2.0。无酚的核酸制品
19、A260A270比值约为1.2。,【实验步骤】,琼脂糖凝胶电泳检测DNA （三）,DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭(EB)，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254365nm紫外线照射下可产生橘红色的荧光，可用于检测DNA。,【实验原理】,1实验器材 电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像系统 2试剂 (1) 5TBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，4.6g EDTANa2溶于去离子水中，定容至1L。电泳时10倍稀释使用。 (2)
20、 溴化乙锭(EB)(5mg/mL),避光保存。 (3) 0.8琼脂糖凝胶：琼脂糖0.8g加至100mL 0.5TBE缓冲液，加热熔解备用。 (4) 6凝胶上样缓冲液：0.25溴酚蓝，0.25二甲苯青FF，30甘油溶于水中，于4保存。 (5) DNA分子量标准Marker。,【实验材料】,常用的电泳缓冲液,凝胶加样缓冲液,使用凝胶上样缓冲液的目的 （双色电泳指示剂）,增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内； 使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利； 以0.5TBE做电泳液时，溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4kb的DNA相同。,1琼脂糖凝胶板的制备：
21、将0.8琼脂糖凝胶加热熔化均匀，冷却到6070加EB至终浓度0.5g/mL，倒入封好的凝胶槽，厚度约35mm，在距底板0.51mm的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶12mm为止。,【实验步骤】,【实验步骤】,2加样：样品中加1/5体积的6凝胶上样缓冲液，混匀，取1015l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。,3电泳：最高电压不超过5V/cm（80100V恒压电泳 ,电流在40mA以上），当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 4观测：取出凝胶块，置凝胶成像分析仪上观察，即可见橘红色的DNA区带。,【
22、实验步骤】,5.结果:不同方法提取的基因组DNA电泳图谱,12000bp,DNA Marker,常用DNA分子量标准参照物,1加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。大多情况下，加样时不必更换枪头，可在电泳槽正极端反复吸打电泳缓冲液清洗。 2上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。 3溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里,【注意事项】,4电泳过程中，EB向阴极移动(与DNA相反)，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5g/mL EB溶液中重新染色后检测。 5加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.10.5g即可有良好的观察效果。如样品为酶切产物(由大小不同的DNA片段组成)，则每孔加2030g DNA也不致明显影响分辨率。 6. 用254nm波长的紫外光进行观察的效果比365nm清晰，但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。,【注意事项】,
