1、SiRNA 真核表达载体阻断 HeLa 细胞stathmin 基因表达研究(1)作者：王燕，吴冰，苏海川，刘丽，林芳，张惠中【关键词】真核表达载体BlockingeffectofvectorbasedsiRNAonstathmingeneexpressioninhumanHeLacells【Abstract】AIM:ToexploretheblockingeffectofsiRNAontheexpressionofstathmingeneinHeLacelllineusingsiRNAeukaryoticexpressionvector.METHODS:TwostathminsiRNAcDNA
2、sweresynthesizedaccordingtothestathmingenesequenceandclonedintothevectorandnamedpSilencerS1andpSilencerS2respectively,whichwerefurtheridentifiedbyrestrictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequencing.HeLacellswerethentransfectedwithpSilencerS1andpSilencerS2.AfterG418selection,thecellswereselected
3、andtheinterferingeffectwasdetectedbyRTPCR.RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequencingresultsshowedthatthe2targetsegmentswereclonedintoneovectorrespectively.TheresultsofRTPCRindicatedthatbothsiRNAvectorscouldsuccessfullyknockdownstathmingeneexpression.CONCLUSION:ThevectorbasedsiR
4、NAonstathmingenecaneffectivelyknockdownstathmingeneexpression,whichhasthepotentialofbeingappliedingenetherapyagainstmalignanttumors.【Keywords】stathmin;RNA,smallinterfering;eukaryoticexpressionvector;HeLacells【摘要】目的：构建人 stathmin 基因的 siRNA 真核表达载体，探讨其对 HeLa 细胞中 stathmin 基因表达的干涉作用.方法：将合成的 siRNA 寡核苷酸链退火形
5、成双链，连接入经 BamH和 Hind双酶切后的 neo 真核表达载体，酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入 HeLa 细胞，G418筛选后 RTPCR 检测其对 stathmin 基因 mRNA 的干涉效果.结果：经酶切及测序鉴定，成功构建 siRNA 真核表达载体.经脂质体转染 HeLa 细胞后，RTPCR 显示所构建的干涉stathmin 基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达，HeLa 细胞中 stathmin 基因的 mRNA 表达水平明显降低.结论：成功构建了人 stathmin 基因的 RNA 干涉真核表达载体 pSilencerS1 和 pSilencerS2，并在 H
6、eLa 细胞中有效地发挥了对 stathmin 基因表达的干涉作用.【关键词】stathmin；RNA，小分子干扰；真核表达载体；HeLa 细胞0 引言Stathmin 为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明1，2通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin 蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达均证实，抑制其表达可使细胞受阻于 G2/M 期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转.因此，stathmin 是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点.RNA 干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解与之序列相对应的细胞内 mRNA,使基因转录后沉
7、默.许多学者3-5认为该技术的出现是基因功能研究及基因治疗研究手段的又一次革命性突破.本试验通过构建针对stathmin 基因的 siRNA 真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内stathmin 基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式.1 材料和方法材料质粒提取试剂盒（Wizard plus Minipreps DNA Purification System）,pGEMTeasy 载体连接试剂盒，逆转录试剂盒 ReverseTranscriptionSystem 购自 Promega 公司.neo 载体及阴性对照 neonegtivecontrol 为 Ambion 公司产品.限制性内切酶 BamH和
8、 Hind为 Takara 公司产品，LipofectamineXX 购自 Invitrogen 公司.TaqDNA 聚合酶，DGLXXDNAMarker 及琼脂糖凝胶购自鼎国生物技术有限公司.HeLa 细胞及宿主菌株大肠杆菌 JM109 为本实验室保存.方法针对 stathmin 基因的 siRNAcDNA 设计和制备根据GenBank 中 stathmin 基因的序列及 siRNA 设计原则，在编码区内选择两段 19nt 作为不同的干涉区域，分别进行BLAST 分析.根据 RNA 干涉载体 neo 的要求分别于上、下游引入 BamH和 Hind酶切位点.每段各设计一对 55 个碱基的序列，
9、由博亚生物技术有限公司合成.两对 stathmin 基因的 siRNAcDNA 序列如下：5GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAATTCAAGAGATTTCTCGTGCTCTCGTTTCAGAAGCTT3，互补链为：5AAGCTTCTGAAACGAGAGCACGAGAAATCTCTTGAATTTCTCGTGCTCTCGTTTCGGATCC3；另一对为：5GGATCCCGTTTGCGAGAGAAGGATATTCAAGAGATATCCTTCTCTCGCAAACGAGAAGCTT3,互补链：5AAGCTTCTCGTTTGCGAGAGAAGGATATCTCTTGAATATCCTTCTCTC
10、GCAAACGGGATCC3.斜体部分为 siRNAcDNA 序列，中间为 Loop.构建 siRNA 的 neo 真核表达载体将合成的互补链分别退火，形成带有粘端的双链，用 T4 连接酶分别连接入线性化的 neo 载体中 BamH和 Hind酶切位点之间.转化 Jm109大肠杆菌，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用 BamH和Hind双酶切鉴定.酶切鉴定正确的克隆送上海基康公司测序，分别命名为 pSilencerS1 和 pSilencerS2.脂质体介导的 HeLa 细胞的转染在 6 孔板内按照105细胞/孔接种细胞，第 2 日转染重组质粒及阴性对照质粒neonegtivecontrol（空
11、载体） ，操作步骤按LipofectamineXX 说明书进行.转染后 48h 换为含 G418 的选择培养基培养，1012d 后获得 3 种质粒转染后的 HeLa 细胞稳定克隆.法检测转染重组质粒 HeLa 细胞中 stathmin 基因表达分别收集 3 种转染后的 HeLa 细胞和未转染的 HeLa 细胞各106,TrizolRNA 分离试剂提取细胞总 RNA.取 5g 总RNA，加入 1Loligo,按照逆转录试剂盒说明书操作，合成cDNA 第 1 链.PCR 引物自行设计.上游引物为：5TACCGAAGAAGACTATAGGT3；下游引物为5ATCAGTCGAAGTCAGAGCA3.取 2L 逆转录产物为模板，PCR 反应参数为：94预变性 3min；94变性 30s，58退火 30s，72延伸 30s，30 个循环；72延伸 10min.并以actin 引物为内参照，上游引物为：5TCTGACACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3，下游引物为：5CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG3，RTPCR 扩增出一条 838bp 的 actincDNA 片段.各取 10LPCR 扩增产物，g/L 琼脂糖凝胶电泳 h，凝胶图像分析仪分析结果.（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
