1、chk1 反义寡核苷酸增加 HeLa 细胞顺铂作用下凋亡敏感性(1)这篇chk1 反义寡核苷酸增加 HeLa 细胞顺铂作用下凋亡敏感性论文是程序自动抓取于互联网上，查看更多请点击：论文频道：lwxz/ 作者：朱克修，王佳，李玢，曹亚莉，韩晓兵 【摘要】 目的：通过反义封闭 chk1 基因，阻断细胞周期检测点信号传导通路，从而增加宫颈癌 HeLa 细胞对顺铂的敏感性.方法：采用 MTT 法检测梯度浓度 DDP 作用人宫颈癌细胞株 HeLa24,48 和 72h 后对细胞的生长抑制率.以脂质体为载体将 chk1 正义链和反义链转染 HeLa 细胞，用 WesternBlot 测量 Chk1 蛋白的
2、表达，用流式细胞仪和TUNEL 法检测 DDP 作用后细胞凋亡率.结果：DDP 对 HeLa 细胞有生长抑制作用，并有时间和浓度依赖性.反义封闭 chk1基因可抑制 Chk1 蛋白表达（P） ，DDP 作用下细胞凋亡率为%,高于转染正义链的%（P）.结论：反义封闭 chk1 基因可增加 HeLa 细胞对 DDP 的凋亡敏感性. 【关键词】 Chk1 基因；反义核酸技术；宫颈肿瘤；顺铂【Abstract】 AIM:Toinvestigatetheeffectofchk1geneincisplatinresistanceofcervicalcancertoblockthesignaltransdu
3、ctionpathwaysofcellcyclecheckpoint,bytargetingchk1geneusingantisenseoligonucleotide,soastoenhancethedrugsensitivityofcervicalcancerHeLacellstoDDP.METHODS:TheproliferationinhibitionratesofHeLacellsbyDDPindifferentconcentrationsweremeasuredbyMTTassay.OligonucleotidewastransfectedintoHeLaexpressionofCh
4、k1 wasobservedbyWesternBlot.TheapoptosisrateofHeLacellsinducedbyDDPwasinvestigatedbyflowcytometryandTUNEL.RESULTS:ThegrowthinhibitionrateofHeLacellsincreasedgraduallyinatimeandconcentrationdependentmanner.Transfectionwithantisenseoligonuleotidetargetingchk1inhibitedtheexpressionofChk1protein,andthea
5、poptosisratewassignificantlyhigherthanthatofthesenseblocking. CONCLUSION:Antisenseblockingofchk1increasestheapoptosissensitivityofHeLacellstoDDP.【Keywords】chk1gene；antisensenucleicacidtechnology;cervixneoplasms;DDP0 引言宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤.近年来以顺铂（cisplatin，DDP）为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中取得了一定进展.有研究认为，细胞周期检测点途径主要由A
6、TM，ATRChk1/2Cdc25A ，Cdc25B，Cdc25C 轴组成1 ，细胞周期检测点激酶 1 属于丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶2.以 chk1 为作用靶点,干扰细胞损伤修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择.我们以 chk1 反义寡核苷酸链转染 HeLa 细胞，观察其化疗后的凋亡敏感性.1 材料和方法11 材料人宫颈癌 HeLa 细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床研究医学分子中心提供.在 37,50mL/L 的 CO2 条件下用含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养.RPMI1640 购自 Gibco 公司；
7、胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT 购自 Amressco 公司；转染试剂LipofectamineTMXX 购自美国 Invitrogen 公司；鼠抗人Chk1mAb 购自 Neomarkers 公司；辣根酶标记的羊抗鼠抗体购自博士德公司；ECL 购自 AmershamBioscience 公司；AnnexinVFITC 试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司.12 方法实验分 4 组：正常对照组，细胞未经任何处理；空脂质体组；转染 chk1 正义寡核苷酸链组；转染 chk1 反义寡核苷酸链组.BD 组转染后用 20mol/LDDP 处理
8、 24h.121 MTT 法检测DDP 对细胞的生长抑制率取对数生长期的 HeLa 细胞，调整细胞密度 5107/L，接种于 96 孔板,200L/孔,培养24h 后 DDP 终浓度为 10,20,40,80 和 160mol/L,每个浓度设 4 个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照（无细胞） ，分别于作用 24,48 和 72h 后加入 5g/L 的 MTT 溶液，20L/孔，继续培养 4h 后，吸去上清，加入二甲基亚砜，150L/孔，振荡器震荡 10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在 490nm 波长处测量 A 值，计算细胞增殖抑制率（%）.绘制 DDP 对 HeLa 细胞的生长抑制曲线.
9、122 转染效率的检测chk1 反义寡核苷酸序列根据参考文献3-4的方法，由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列为：chk1 反义链：5GGCACTGCCATGACTCCA3; 正义链：5TGGAGTCATGGCAGTGCC3, 采用全硫代修饰，部分寡核苷酸链的 5端以 FITC 标记.严格按照LipofectamineTMXX 试剂说明书进行转染，于转染前 1d 用无抗生素的含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 调整细胞密度为108/L，接种于 24 孔板，500L/孔.转染当天换为500L 无抗生素无血清 RPMI1640.分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链加到 50L 的
10、RPMI1640 中，混匀.再取LipofectamineTMXX2L，加到 50L 的 RPMI1640 中混匀.室温放置 5min 后，将分别混有寡核苷酸链和LipofectamineTMXX 的 RPMI1640 混合，室温放置20min（寡核苷酸链与脂质体比值分别为g2L；g2L 和 g2L）.将上述混合物加入24 孔板中，轻轻混匀，培养 6h 后,将培养基换为 500L含 100mL/L 胎牛血清的 RPMI1640，继续培养至 24h，荧光倒置显微镜下观察转染效率.123 WesternBlot 法检测Chk1 蛋白表达裂解提取 HeLa 细胞总蛋白，按Bradford 法进行蛋白
11、定量，煮沸 5min 使蛋白变性，120g/L的 SDSPAGE 电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于 50g/L 脱脂奶粉中室温封闭 1h，以鼠抗人的 Chk1mAb按 1400 室温孵育 h，用 TBST 洗膜 6 次，每次 3min，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗 1500 室温孵育 1h，TBST 洗膜 6 次，每次 3min,以 ECL 显色,X 光胶片暴光，洗片.用凝胶成像系统检测蛋白表达灰度值.124 细胞凋亡的检测收集细胞，调整细胞浓度为 1108/L,取细胞1mL，PBS 洗涤后将细胞悬于 BindingBuffer200L，加AnnexinVFITC10L ，混匀，室温避
12、光孵育 15min，再加入 BindingBuffer300L 和 PI5L，流式细胞仪检测细胞凋亡.另将 HeLa 单细胞悬液接种于 24 孔培养板培养，使细胞爬于盖玻片，按上述各组方法处理细胞后捞出盖玻片，40g/L 多聚甲醛固定，按 TUNEL 试剂盒说明进行操作.统计学处理：重复 3 次实验，实验结果采用 SPSS 统计软件进行方差分析及两两比较，P为差异具有统计学意义.2 结果21 DDP 对 HeLa 细胞的生长抑制作用结果显示，A组 HeLa 细胞体外生长良好，10mol/LDDP 作用 HeLa 细胞24h 后抑制效应不明显，20，40，80 和 160mol/LDDP 对He
13、La 细胞有抑制效应，且随着时间的延长和浓度的增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点（图 1）.由于 20mol/LDDP 作用 24h 后对细胞已有明显的抑制作用，因此后面的实验中选用 20mol/L 为药物处理浓度.22 寡核苷酸转染效率用 FITC 标记的寡核苷酸转染HeLa 细胞，24h 后用荧光倒置显微镜观察转染效率，发现DNA/LipofectamineTMXX 脂质体比率为g2L；g2L 和 g2L 时的转染效率分别为%，%，%，其中 DNA/LipofectamineTMXX 脂质体比率为g2L 时转染效率最高.23 HeLa 细胞 Chk1 蛋白的表达转染 chk1
14、 反义寡核苷酸可明显抑制 Chk1 蛋白的表达（图 2） ，与 A 组，B 组和C 组比较差异具有统计学意义（P）.24 chk1 反义寡核苷酸对顺铂作用下 HeLa 细胞凋亡的影响转染 chk1 反义寡核苷酸后 DDP 诱导的细胞早期凋亡和晚期凋亡总共有%,P ，高于 C 组%,P ，说明转染chk1 反义寡核苷酸可增加 DDP 诱导的 HeLa 细胞凋亡.TUNEL染色显示,转染 chk1 反义寡核苷酸链后 HeLa 细胞在 DDP 作用下凋亡率为%，是 C 组凋亡率（%）的倍，检测结果与AnnexinV/PI 流式细胞仪检测法获得结果一致（图 3）.（作者：未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
