1、PDCD5 基因在初诊 Graves 病患者PBMCs 中表达情况的初步研究(1)作者：金秀平，李明，赵杰，马绍杰，贾伟，陈冬，吴乃君，张秀军 【摘要】目的探讨促凋亡基因 PDCD5mRNA在初诊 Graves 病患者外周血单个核细胞中的表达。方法半定量 RTPCR 法检测 53 例初诊 GD 患者外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 表达的阳性率和表达水平。结果 35 例PDCD5mRNA 在 GD 患者 PBMCs 中表达呈阳性，阳性率为%，较正常对照者升高；其表达水平显著高于正常对照，且 GD 患者高 T3 水平组 PDCD5mRNA 的表达显著高于低 T3 水平组。结论 PDCD5mR
2、NA 在 GD 患者 PBMC 表达升高，可能与 GD 淋巴细胞凋亡异常有关。【关键词】PDCD5；Graves 病；凋亡；外周血单个核细胞；反转录 聚合酶链式反应ApreliminarystudyontheexpressionofPDCD5inperipheralblood monocytesfrompatientswithuntreatedGravesdiseaseABSTRACT:ObjectiveTostudytheexpressionofPDCD5inperipheralbloodmonocytesfromnormalsubjectsandpatientswithuntreatedG
3、ravesdisease.MethodsTheexpressionofPDCD5wasassayedbysemiquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction.ResultsPositiveratewassignificantlyhigherinGDgroupsthaninnormaldonorgroup.TherelativeexpressionlevelwasalsohigherinGDgroupsthaninnormaldonorgroup.AsignificantlyhigherexpressionofPDCD5wasob
4、servedinGDpatientswithahigherT3levelthanthatinthelowerT3levelpatients.ConclusionTheseresultssuggestthatthehigherexpressionofPDCD5mRNAmaybeinvolvedinabnormalapoptosisoflymphocytesinGDpatients.KEYWORDS:programcelldeath5;Gravesdisease;apoptosis;PBMC;RTPCRPDCD5 即程序性细胞死亡因子 5 是由北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞株 TF1 细胞中
5、克隆得到的，是我国拥有自主知识产权的新功能基因，具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应。研究发现 PDCD5 在桥本病甲状腺滤泡细胞中阳性表达，而在正常甲状腺细胞中几乎不表达1。PDCD5 在初诊未治疗的 GD 患者中的表达情况尚未见报道。为此，我们通过半定量 RTPCR 方法测定了 35 例 GD 患者外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 的表达情况，并探讨了 PDCD5的表达与 GD 病的相关性。1 材料与方法研究对象与主要试剂研究对象：GD 组为目的基因阳性表达的患者 35 例，平均年龄岁，均为就诊于我院内分泌科门诊或病房的患者，均未给予抗甲状腺治疗。依临床表现、甲状腺功能检测结果以及甲状
6、腺核素扫描等临床诊断，确定为 Graves 病。所选对象均为初诊患者，且无其他自身免疫性疾病、肿瘤及内分泌疾病病史。按 T3 水平分为 GD1组 16 例，GD2 组 19 例。正常对照组 18 例，为本院健康查体人员，其中 10 例目的基因呈阳性表达，平均年龄岁。主要试剂：TrizolRNA 提取试剂和 2TaqPCRMasterMix 均购自天根生化科技有限公司，MMLV 逆转录试剂盒购自PROMEGA 公司。细胞的分离取研究对象的静脉血，EDTA 抗凝，按常规用 Ficoll 密度梯度离心分离单个核细胞。半定量 RTPCR 检测 PDCD5 基因的表达 mRNA 的提取按Trizol 总
7、 RNA 分离试剂盒说明书进行。离心收集约 1106细胞，顺次加入 Trizol 提取液、氯仿、异丙醇提取细胞的总 RNA。紫外分光光度仪分别在 260nm 和 280nm 波长下分析RNA 的吸光值，测定 RNA 的纯度并定量。cDNA 合成按MMLV 逆转录酶产品说明书推荐的方法。在 Ep 管中分别加入 2g 总 RNA、Oligo18、dNTP、5MMLV 逆转录酶缓冲液、DTT、Rnasin、MMLV 逆转录酶和 DEPCH2O，反应体系为 40L。逆转录条件为：371h，然后 7210min。PCR反应：取 2LcDNA，加入 PDCD5 特异性的引物、2TaqPCRMasterMi
8、x 和去离子水，反应体系为50L。PDCD5 引物序列为：上游引物5CAACAGGAAGCAAAGCAC3 ；下游引物为5GATCTTAACTTCTGTCCTAGAC3 ，扩增片段长度为384bp。以 actin 为内参照，其引物序列为：上游引物5CCCAGGCACCAGGGCGTGATGGT3 ；下游引物为5GGACTCCATGCCCAGGAAGGAA3 ，扩增片段长度为701bp。PCR 反应条件为：943min 预变性，然后 9440s变性，6145s 退火，7250s 延伸，共 35 个循环，最后7210min 结束反应。将 8LPCR 产物加样至 10g/L 琼脂糖凝胶样品孔中，在
9、1TAE 电泳缓冲液中电泳鉴定 PCR 产物，紫外灯下观测电泳结果，BIORADGDXX 凝胶成像系统照相记录实验结果，用 QuantityOne 软件测定每个条带的吸光值，并计算样品 PDCD5 条带与内参照 actin 条带的吸光度比值。用相对吸光度单位表示 mRNA 表达量,相对吸光度单位=PDCD5 吸光度单位/actin 吸光度单位100%。PCR 产物的测序与 DNA 同源性分析：为证实 PCR 产物确为 PDCD5 扩增片段，对扩增产物进行直接序列测定，将 50L 已纯化的 PCR 产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行 DNA 序列测定。测序结果应用 BLAST 软件与Ge
10、nBank 序列进行同源性分析。统计学处理应用统计软件进行数据统计与分析，各组结果以s 表示，各组之间均数比较用 t 检验，PDCD5 基因阳性率的比较用 2 检验。2 结果序列测定 PDCD5 基因 PCR 扩增产物进行双向序列测定，经与 GenBank 序列对比，同源性均为 100%，证实 PCR 产物的正确性。正常人外周血单个核细胞 PDCD5 基因的表达在 mRNA 水平上，用 RTPCR 方法研究了正常查体人员 PBMCsPDCD5 基因的表达。结果表明，PDCD5 的 mRNA 在正常人外周血单个核细胞中表达的阳性率%，表达量平均为。Graves 病患者外周血单个核细胞 PDCD5 基因的表达35 例 GD 患者 PDCD5mRNA 呈阳性表达，表达阳性率为%，其平均表达强度为，经 2 检验，正常对照组与 GD 组PDCD5 阳性率无统计学差异。经 t 检验，外周血单个核细胞PDCD5mRNA 的表达强度在 GD 组显著高于正常对照组。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
