1、GFP 作为报道基因在研究 WT1 基因调控元件中的应用(1)作者：胡绍燕 陈子兴，赵晔，傅铮铮，何军，岑建农，谷敏【摘要】 本研究调查 EGFP 基因作为报道基因在研究 WT1 基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术分别将 WT1 基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP1 载体中，转化感受态菌细胞，筛选了阳性转化菌落，通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落，抽提重组质粒 DNA；同时将重组质粒转染 K562 细胞，通过荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明：通过基因重组技术分别构建了含有 WT1 基因启动子的载体（pEWP）和含有 WT1 基因启动子和增强子的载体（pE
2、WPE、pEWPA 和pEWPD） 。转染 48 小时后，pEWP、pEWPE、pEWPA 和 pEWPD的 K562 细胞在荧光显微镜下能够显示荧光，而转染了空载体 pEGFP1 的 K562 细胞未出现荧光。结论：EGFP 基因作为报道基因可以用于 WT1 基因调控功能的研究，为进一步开展基因治疗创造了条件。【关键词】EGFP；WT1 基因；启动子；增强子；K562细胞ApplicationofEGFPasReporterGeneinStudyofWT1RegulationElementsAbstractInordertoinvestigatethefeasibilityofusingEG
3、FPasareportergeneinWT1transcriptionalregulationstudy.WT1promoterandenhancerwereligatedintothevectorpEGFP1byrecombinantDNAtechniqueandconfirmedbyrestrictionenzymesdigestion.TheresultantconstructsweretransfectedintoK562celllinebyDMRIECreagentandthefunctionoftheseWT1geneelementswasdetectedbyusingafluor
4、escentmicroscopeaftertransfectionfor48hours.Theresultsindicatedthattherecombinantvectors,pEWPcontainingWT1promoter,andpEWPE,pEWPAandpEWPDharboringbothWT1enhancerandpromoter,hadbeensuccessfullyconstructed.FluorescencewasobservedinK562cellstransfectedbypEWP,pEWPE,pEWPAandpEWPD,whilenofluorescencecould
5、bedetectedincellstransfectedbypEGFP1.ItisconcludedthatEGFPgeneasareportergenecanbeappliedtotheWT1transcriptionalregulationstudy,whichprovidesthebasisforgenetherapy.KeywordsEGFP;Wilmstumorgene;promoter;enhancer;K562cellWT1 基因是一个参与转录调控的双相调节子，它与各种造血调控因子相互作用，在白血病发病过程中起重要作用。近十几年的研究证实，80-90的急性白血病中 WT1 基因高
6、表达1，2 ，且随着病情的进展表达增高，被认为是一种“泛白血病”标志3 ，有可能成为白血病基因治疗和特异性免疫治疗的新靶点。绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因及其载体是近年来研究活细胞中基因表达和蛋白定位的新型报道基因，已成功表达于多种原核生物和真核生物4 。本研究将 WT1 基因启动子、增强子片段连接到携带突变型绿色荧光蛋白报道基因而自身无启动子、增强子的载体 pEGFP1 中，通过检测瞬时转染后 K562 细胞的荧光强度以确定重组载体用于研究 WT1 基因转录调控功能的可行性，进而为研究 WT1 启动子和增强子用于白血病的基因治疗奠定基础。材料和方法
7、主要材料携带 WT1 启动子和增强子的质粒（-）由美国FraizerGC 博士惠赠；pEGFP1 载体购自BectonDickinsonBiosciences 公司。E.coliDH5 为本实验室保存。琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒为 Qiagen 公司产品；T4DNA 连接酶和限制性核酸内切酶BamH、Hind、Pst、Sal、Not、Hpa为 MBI 公司产品，Afl和 Stu为 TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为 Promega 公司产品；Klenow 片段为上海华美生物公司产品；PEG8000 为上海生工公司产品。蛋白酶 K、DNA 分子量标准
8、/Hind、100bpDNALadder、100bpDNAplusLadder、pUC19/Msp购自 MBI 公司。卡那霉素、Xgal 和 IPTG 为Sigma 公司产品。脂质体 DMRIEC 为 Invitrogen 公司产品。荧光显微镜为 LeicaQ550CW 型。重组载体构建WT1 基因启动子的构建取 2g（-）进行 Hind/Pst双酶切，反应产物经%的琼脂糖凝胶电泳，切下 WT1 基因启动子片段，按琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒按说明书纯化凝胶中的 DNA 片段。WT1 启动子与经过 Hind/Pst双酶切的 pUC18 载体连接、测序，证实 WT1 基因启动子序列正确。再将
9、WT1 启动子与经过 Hind/Pst双酶切的 pEGFP1 载体连接。WT1 基因增强子的构建取 20g（-）进行 BamH酶切，纯化的 DNA 片段与 pUC18 质粒连接、测序。将切下的 WT1增强子片段分别插入载体 pEWP 的不同位点（MCS 多克隆位点，Not位点和 Afl位点） ，通过粘端连接将 WT1 增强子与经 BamH酶切后的 pEWP 连接，使 WT1 增强子连接到pEWP 的多克隆位点上，通过平端连接将补平后 WT1 增强子分别连接到补平且去 5磷酸化的 pEWPAfl位点和 Not位点上实现。细菌转化利用电穿孔技术将上述重组质粒转化到 DH5 感受态细胞中，取 250
10、l 的电击转化细菌铺于含 30g/ml 卡那霉素的 LB 培养基的琼脂板上，37倒置培养 16-20 小时。挑取阳性菌落扩大培养后，提取质粒进行酶切鉴定。细胞培养与转染白血病细胞株 K562 细胞于 37、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。含体积分数 15%胎牛血清（FCS） （杭州四季青公司）的 RPMI1640（Gibco/BRL）完全培养液进行常规培养。将 l 的 DMRIEC 脂质体稀释于 100lOPTIMEM 无血清培养液中，同时取另 1 份 100lOPTIMEMI 无血清培养液稀释 g 重组质粒，5 分钟后将二者混合，室温放置 45 分钟以形成 DNA 脂质体混合物。用 OPT
11、IMEM 无血清培养液调整 K562 细胞浓度，使其达到 8106/ml，每孔加入50l（相当于 4105 细胞） ，再将 DNA 脂质体混合物滴入，5 小时后补充 40l 胎牛血清和 1mlRPMI1640 完全培养液继续培养。于 48 小时用 LeicaQ550CW 荧光显微镜在 FITC滤光镜激发下观察细胞的荧光强度。结果WT1 基因启动子的构建与鉴定pUC18/WT1 启动子连接与鉴定 1gpUC18/WT1 启动子连接产物进行 Hind/Pst双酶切，经%的琼脂糖凝胶电泳，得到两个片段，大小分别为 kb 和 652bp（图 1） 。测序结果显示 WT1 启动子的序列正确。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
