1、Bcl2 和 bad 蛋白表达与皮肤血管瘤的相关性研究(1)【摘要】目的：探讨 bcl2 和 bad 基因在血管瘤组织中的表达及相关性。方法：采用免疫组织化学方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中 bcl2 和bad 基因的表达水平。结果：Bcl2 在增生期血管瘤内皮细胞的表达明显高于退化期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞（P） ；Bcl2 在退化期血管瘤内皮细胞的表达与正常皮肤组织血管内皮细胞相比，差异无显著性（P） 。bad 在退化期血管瘤内皮细胞的表达明显高于增生期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞（P） 。结论：bcl2 和 bad 参与了血管瘤的发生、发展和
2、退化；Bcl2 通过抑制内皮细胞凋亡而促进血管瘤的增生；bad通过诱导血管瘤内皮细胞的凋亡而促进血管瘤由增生向退化的转变。【关键词】bcl2 ；bad；血管瘤；凋亡；免疫组织化学皮肤血管瘤是好发于婴幼儿的一种常见良性肿瘤。内皮细胞过度增殖和血管迅速生长是血管瘤病理组织学的最大特点，也是血管瘤发生的实质。根据内皮细胞生长、摄取 3H 胸苷、肥大细胞计数、纤维细胞形成以及脂肪浸润等将血管瘤分为：增生期、退化期和退化完成期三个时期，但至今其病理演变的确切机制仍不十分清楚。近年来研究表明血管瘤是一种血管过度形成的良性肿瘤，血管内皮细胞的过度增殖和血管形成在血管瘤病理演变过程中起着很重要的作用，而关于影
3、响血管内皮细胞的过度增殖和血管形成因素的研究越来越引起科研工作者的重视。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。Bcl2 和 bad 是在调控细胞凋亡过程中的比较重要的蛋白质，它们在许多恶性肿瘤中的研究比较多，而在血管瘤这种良性肿瘤中的研究，尤其是在血管瘤不同时期表达的研究，国内外尚未见报道。本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了 Bcl2 和 bad在血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤血管
4、中的表达，以探讨 Bcl2 和 bad 在血管瘤由增生向退化转变过程中的作用机制。1 材料和方法11 材料111 材料来源收集武汉大学人民医院病理科 XXXX年皮肤血管瘤存档蜡块 50 例，其中男性 25 例，女性 25 例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。112 材料分组蜡块切片厚 5m，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规 HE 染色和免疫组织化学 SP 法检测增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA） ，按Mulliken 分类标准并结
5、合 PCNA 的表达进行分组：增生期血管瘤 22 例，退化期血管瘤 28 例，另取瘤组织周围正常皮肤组织 5 例作对照。12 主要试剂和仪器121 主要试剂即用型鼠抗人 PCNA 单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司） ；即用型兔抗人因子相关抗原多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司） ；浓缩型鼠抗人bad 单克隆抗体（美国 SantaCruz 公司） ；浓缩型鼠抗人Bcl2 单克隆抗体（美国 SantaCruz 公司） ；超敏即用型SP 通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司） ；DAB 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司） 。122 主要仪器 YWY781 型医用微波仪；
6、家用高压锅。13 方法131 常规 HE 染色取材、固定、脱水、透明、切片和 HE 染色132 免疫组织化学 SP 法检测bad、Bcl2 、PCNA 和因子相关抗原主要步骤：组织切片 5m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；3%过氧化氢，37孵育 10min 以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS 洗45min；bad、Bcl2 采用微波抗原修复（3 档，10min） ，PCNA 采用高压抗原修复，因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，PBS 洗 45min；正常羊血清 37孵育10min 以减少非特异性反应；一抗（bad，1:150；Bcl2 ，1:50)37孵育 1h，PBS 洗45min；生物素标记的二
7、抗，37孵育 10min，PBS 洗45min；链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶复合物 37孵育 10min，PBS 洗 45min；DAB 显色液显色，自来水冲洗终止反应；苏木精复染，脱水，透明，封片。用 PBS代替一抗作为阴性对照，人扁桃体作为 bad、Bcl2 的阳性对照，人正常皮肤表皮作为 PCNA 的阳性对照。14 免疫组织化学结果判断 Bcl2 、Bcl2 和因子相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，PCNA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIASXX 高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对 B
8、cl2 和的 bad 表达进行定量分析，每张切片随机选取 5 个完整而不重叠的高倍镜视野（400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率（阳性面积率单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积100） 。以每例 5 个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。15 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和 SNKq 检验，检验水准 为。2 结果21HE 染色正常皮肤组织中的毛细血管由 12 个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄，仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。增生期血管瘤组织中可见内皮
9、细胞增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染；内皮细胞有的围成血管腔，有的不围成血管腔而呈团块状。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞数量减少，内皮细胞核扁平；血管腔增大，血管间结缔组织增多。有时在同一个标本中，可以同时见到典型的增生期和退化期区域。22PCNA 的表达增生期血管瘤内皮细胞核肥大，核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA 表达强。退化期血管瘤内皮细胞核扁平，大多数细胞核被苏木精染成蓝色，少数胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA 表达弱。23 因子相关抗原的表达增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。24Bcl2 的表达增生期血管瘤内皮细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒；退化期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积。图像分析结果显示见表 1。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P)。经 q 检验，增生期组与退化期组之间、增生期组与正常皮肤组之间，Bcl2 的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P)，退化期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P） ，见表 1。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
