1、植物细胞质雄性不育分子机理研究进展;J7 332-植物学通报 2o0o,17(4):319332d 成 n,any植物细胞质雄性不育分子机理研究进展逮堑周培疆卷趟-(武汉大学生命科学学院遗传学研究所武汉 43otn2)z(安徽农业大学生物技术研究中心合肥 230036i.摘要本文从线粒体基因组,线粒体基因,线粒体转录 RNA,线粒体蛋白,转基因植物及花粉败育机理六个方面详细介绍了植物细胞质雄性不育分子生物学研究的技术和方法综述了植物细胞质雄性不育分子机理研究的进展,并对植物细胞质雄性不育分子机理的前景作了展望.关键词蜘盥厦韭鲑丕直,线粒体 DNA,线粒体 RNA,线粒体蛋白龆机.讳和.j 物P
2、l-0oftlleStudiesonMolecularMachanismofCytoplasmicMaleSterility,LINGXing-YuanZHOUPei-JangZHUYing-Guo(1n.uleof 白 ,岛毕, Un/t-y,wdn430)(TheCe.erm,如唧,HefeiZ300)AIIsllaetThetechnologyandmethodsofthestudvonmoloularmechasmofCytoplasmMaleSterilhy(CMS)areintroduxlingaIdtomitochondrialgenome,mitochondrialgene,m
3、itochondri?alRNA,mitochondrialprotein.transfomledplantsandabortionofpollen.Ttlepmgresofthestud?ieso11molecularmechanismofCMSisreviewedanditspmspecaredescribed.KeywordsCytoplasmmatesteril(CMS)1MitochondriaXDNA(mtDNA),MitochondriaRNA(mtRNA),Mitochondrialprotein细胞质雄性不育(CMS)在高等植物界普遍存在,是作物杂种优势利用的基础.大量遗传学
4、,细胞学和生物化学的研究表明,线粒体 DNA(mtDNA)的某些改变与细胞质雄性不育存在一定联系(Olin.SOil,1991).由于 mtDNA 的改变涉及线粒体基因组,线粒体基因,线粒体基因转录以及线粒体蛋白等各个层面,因此各个层面均可能与细胞质雄性不育有关.以下对上述几方面与细胞质雄性不育关系的研究进展加以综述.1 植物线粒体基因组与细胞质雄性不育1.1 植物线粒体基因组的特点与动物,真菌以及一些低等植物的线粒体基因组相比,高等植物线粒体基因组有以下几个特点:1)基因组庞大,且大小差异悬殊.高等植物线粒体基因组一般都在 200kb以上,有的可达 25OOkb.2)基因组构型复杂多变,其构
5、型主要有开环,闭环,超螺旋,线状和多聚体等,环状还有主环和次环之分,且次环分子的种类和数目往往可变.3)有的植物线粒体基因组中含独立存在且能自我复制的所谓线粒体质粒.4)植物线粒体基因组大小相黑 ;苍教授 ,1999 年武汉大学博士的研究工作,发表论文 10 泉篇.320 植物学通报 17 卷对其编码能力显得大大冗余,基因组含有大量的非编码序列,重复序列,甚至其它来源的序列1.2 植物线粒体基因组差异与细胞质雄性不育由于线粒体基因组庞大,在比较正常胞质和不育胞质线粒体基因组差异时难以进行整基因组全序列分析.但通过比较玉米,小麦,水稻,油菜,高粱和向日葵等正常和不育胞质线粒体基因组限制性酶切物理
6、图谱,发现两者线粒体基因组组织结构差异较大,两者不仅在同源序列,功能基因排列顺序和方向有差异,且都含非同源序列(1wahashi 等,1992;1.onsdaie 等,1984;Sicullella 和 Palmer,1988)REFA(restrictionenz,trmefragmentanalysis)技术是另一种经常采用的方法 Levints和Dewey(1976)利用该方法研究玉米正常胞质和 T-CMS 胞质线粒体基因组时发现两者的酶切图谱存在明显差异.Kadowaki 等(1986),M101.m 等(1987),杨金水和Walbot(1995)对水稻的研究也得到了同样结果.类似的
7、研究还有黑麦,高粱,甜菜,珍珠粟,毒麦草和虾荑葱等(Steinbom 等,1993;肌 I1g 等,1982;Weihe 等,1991;Rajeshwari 等,1994;Kiang等,1993;Potz,1993).该法有时很有效,研究者可以得到不育或可育胞质特异 mtDNA 片段,如Kiang 等(1993)通过比较毒麦草正常和不育胞质 mtDNA 酶切条带克隆了正常胞质特有的5.6kbHindllI 条带,并以此为探针从不育胞质 mtDNA 文库中筛得一部分同源的7.4kh 片段,经制作对应两片段精细酶切物理图谱最终找到了不育系特有的 4.5kb 片段.RAPD(randomlyrain
8、edpolymorphicDNA)及 AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasee,hainreaction)技术简单,快速,目前常被用于细胞质雄性不育系和保持系之间 mtDNA的比较.许仁林等(1995) 运用 AP-PCR 技术比较了野败型水稻珍油 97A,保持系珍汕 97B以及 F1杂种的 mtDNA 多态性,结果从雄性不育系中得到一个特异的扩增片段 ;黄占景等(1997)运用 RAPD 方法对小麦 A 型不育系 75.3369A 和相应保持系 75-3369BmtDNA 进行了比较研究,发现两者有多态性;蔡胨畦等(1998)对水稻野败型细咆质雄性不育系珍汕97
9、A,保持系珍汕 97B,F 代汕优 63 三者之间和另一种孢子体细胞质雄性不育系马协 A,保持系马协 B,Fl 代马协 63 三者之间 mtDNA 的比较也获得同样结果 .AFLP(amplifedfrontlen 目 thoolrmowhi)是一种更新的分子标记技术,它分辨率高,无假阳性,所需DNA 量少,特别适于象 mtDNA 这样获取样品困难的材料研究 ,但这方面的报导极少(凌杏元等,1999).上述方法所获得的不育和正常细胞质线粒体 DNA 的多态性涉及全基因组,范围广,差异片段多且复杂+对不育性的形成不可能全都有意义,因此有必要分离和克隆这些差异片段并作进一步的分析和鉴定.1.3 线
10、粒体质粒与细胞质雄性不育许多研究者发现不育和可育胞质线粒体质粒不同,一些不育胞质特有的质粒往往被认为与细胞质雄性不育性有关,如水稻肌型不育系中的 B_,和水稻红莲型不育系中的m3 等(Yhi,1983;梅启明和朱英国,1990).玉米 S 型细胞质雄性不育系线粒体质粒 s-1 长 6397bp,S-2 长 5453bo,S-1 具三个阅读框,S-2 具二个阅读框,这些阅读框可能编码与自身复制和维持相关的蛋白质(Levints和 Sederhoff,1983).S-1,S-2 最大的特点是两端具有倒转重复序列,推测 S 因子两端倒转4 期凌杏元等:植物细胞质雄性不育分子机理研究进展重复序列同主环
11、同源序列的重组所引起的某些线粒体基因编码的改变是不育性产生的原因,因为在些育性回复突变体中检测不到游离的 S.1,S-2 因子,而且核基因影响包括 S.1,S-2 因子同源序列在内的线粒体 DNA 组织结构(Loida 等,】990).1.4 线粒体基因组的重复序列等与细胞质雄性不育植物线粒体基因组中存在大量的重复序列.这些重复片段在 110kb 之间,但最小的只有 7bp,最大的可达几百个 kb;如在育性回复的 T-CMS 型玉米线粒体基因组中有一段 165kb 的重复,而 CMS 矮牵牛线粒体基因组中重复片段竞长达 252kb(Fauron等,1990;Folkerts 和 Hxq/tBo
12、tl,1991).线粒体基因组具有大量重复序列的特点与细胞质雄性不育的关系密切.因为重复序列介导了基因组的重排,而重排能产生基因新的表达调控方式,甚至产生新的基因.一些与细胞质雄性不育密切相关的所谓“嵌合基因“ 如玉米的妇座位和矮牵牛的 p 座位等就是基因组 DNA 重组的产物(Dcy 等,1986;Hanson 和 CoMe,1989).高等植物线粒体基因组中还常含有其它来源的 DNA 序歹!】.玉米叶绿体和线粒体基因组有 l2.1kb 的同源区,其同源性大于 90%,该同源区包括 16SrRNA 基因 3端部分,两个 tRNA 基因和 1.5-=磷酸核糖羧化酶大亚基基因 (Stem 和 L
13、onsdale,1982).Green和Marechal 在线粒体基因组中找到了核 tDNA 基因片段(Green 等,1987);而在核基因组中Nawa 等(1987)也发现了线粒体和叶绿体基因片段.以上结果说明,高等植物细胞内的三大遗传系统之间存在遗传物质的交换.因此,在遗传学理论研究中不应把三个遗传系统中任一系统的遗传功能孤立起来并试图解释错综复杂的生物遗传现象(如细胞质雄性不育性),忽视它们之间的相互联系,显然是不适当的(李继耕,1992).2 线粒体基因与细胞质雄性不育高等植物线粒体基因组尽管非常庞大,但所编码的功能基因有限.拟南芥线粒体基因组 DNA 是至今唯一全序列测定的高等植物
14、线粒体基因组,全长 366924bp 的DNA 序列只编码 57 个基因.高等植物线粒体基因的编码序列保守性很强,而编码区以外的序列则保守性很低,这个特点有利于利用已知基因研究其它各种植物线粒体基因的多态性变化.在植物线粒体 DNA 中还含有一些开放的阅读框架,它们能转录,但其功能和编码蛋白还不清楚.这些阅读框有的是通过线粒体基因组重排而形成的嵌合基因;在不同植物中已发现的近 20 个不同嵌合基因中有的与植物雄性不育性有关(kIs0n 和Folkets,1992).2.1 确定细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段的方法确定与细胞质雄性不育相关基因或基因片段,可采用以下几种材料:1)不育系和保持
15、系;2)不育系和育性自发回复突变体;3)组培或原生质体融合分化产生的不育和可育植株.可以采用如下方法:1)用已知线粒体基因作探针对上述材料线粒体 DNA 进行RFLP分析或 Northern 分析,寻找二者间存在差异的基因;2) 用限制性内切酶消化不育和正常胞质线粒体 DNA,直接从分离胶上回收并克隆不育或正常 mtDNA 特异片段;3)用AP-PCR,RAID 或 AFLP 等方法比较正常和不育胞质线粒体 DNA 差异,克隆不育系特异的扩增片段;4)用差异展示的方法,寻找不育与正常胞质线粒体差异 RNA.以上 4 种方法获得的差异片段可直接作为探针从线粒体 DNA 文库或 eDNA 文库中筛
16、选阳性克隆,进而确定与细植物学通报 17 卷胞质雄性不育有关的阅读框.2.2 与细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段与玉米 T-CMS 有关的线粒体基因为 ufr-13(Dewey 等,1986),不育系的该位点是基因组经过 7 次重组所形成的嵌合基因,它含有 mu?6 基因和啦基因的部分序列; 该位点靠近线粒体 DNA 的重复序列,可以编码 l3kD 的线粒体多肽.玉米 CCMS 不育系啦,0 勾和 cox/基因区域和正常可育的结构有差异,推测可能与玉米 CCMS 不育性有关(和 Dewey,1988;Dewey 等 ,1991).玉米 S-CMS 不育性可能与线粒体质粒 sl,s2 有关(
17、B.cote-Carlson 等,1988), 但近来研究发现不育系线粒体基因组一段 R 重复序列可能与不育性关系密切(Zobala 等,1997).矮牵牛是除 T-CMS 玉米外 ,细胞质雄性不育机理研究最为透彻的植物,它只有一种细胞质雄性不育类型,受单一核恢复基因影响,其不育性与 p 位点有关(Young 和Haason.1987;Yesodi 等.1997).p 位点也是经基因组重复产生的嵌合基因,含 carll 编码序列,可以编码 25kD 的线粒体多肽.该位点被定位于 443kb 的线粒体主环分子上(Folkerts和 Hanson,1989).向 13 葵细胞质雄性不育系和保持系的
18、 mtDNA 只发现在嘞基因位点附近存在差异.在该位点附近保持系和不育系都含一个 12 的倒位片段,但不育系多一个 5 的插入,结果形成新的与 CMS 有关的 22(Leroy 等,1985;Crouzillat 等,1987)o水稻 BT-CMS 不育系线粒体的 DNA 含两个啤基因,而保持系只有一个.序列分析表明,不育系两个 n 基因中的一个与保持系完全一致,只是在终止子下游 49 位产生歧化.另一个 6 基因是一个嵌合基因,来源于线粒体 DNA 分子内重组,Kodowaki 将它定名为f-rmc(I(日 daki 等,1989;1990).水稻野败型不育系和保持系除前述发现线粒体DNA
19、酶切带谱有差异外,还发现 cox/,carll,carlll,呻 6,婶,9,嘶 d,cob 等位点区域组织结构或拷贝数有差异(刘炎生等,1998;李大东和王斌,1990;扬金水和】b 叶,1995;Mignouna等.1987;Kadowaki 等,1988).水稻红莲型细胞质雄性不育系和保持系线粒体 DNA的差异仅见梅启明等的报导(梅启明和朱英国,1990).大多数小麦不育系来自于普通小麦和提莫菲维小麦的杂交后代,T-CMS 小麦体细胞培养再生不育和可育株呻 6 基因附近有差异(Pfei 等,1994;Schmit 等,1996);而 T-CMS 小麦不育系和保持系 carl 区域有差异,
20、不育系 carl 上游多一个 o256,估计不育系啦基因区域以及 orf256 可能与 T-CMS 小麦不育性有关 ;另外,有人还发现 T-CMS 小麦不育系和保持系 n,们以及确也有差异(吴敏生和刘大钧,1994).对于 K-CMS 和 VCMS小麦李传友和王斌发现不育系和对应保持系,0 勾,cob 基因附近有差异.而黑麦不育和正常胞质的 n 和 coM 位点有差异(RoIwend 且 l 等,1992).油菜波利马细胞质雄性不育系是生产上利用的主要胞质类型,其不育性与呻位点区域嵌合基因 oq224 有关(LHmrzm 和 Brown,1993;Wang 等,1995). 另一种油菜不育胞质
21、类型(B.toumefortii)的不育性则与 n 基因下游的啦国有关(Id 目等,1996).高粱细胞质雄性不育的不育性可能同啤和 cod 的组织结构或拷贝数变化有关(Baihv.Serres 等.1986),但近来研究表明它可能同嵌合基因 07 有关,该 oC/107 含婶,9同源序列,能编码 11.85kD 的多肽(Tang 等,1996).4 期凌杏元等:植物细胞质雄性不育分子机理研究进展甜菜 CMS 不育胞质基因附近有重组发生 ,其序列和转录也发生改变 (Senda 等,1993).Xue 等(1994) 发现不育胞质 mtDNA 存在一个特异的阅读框,它与 o_,p6 基因共转录.
22、也有研究表明甜菜细胞质雄性不育可能同一个 1,3kb 的质粒有关(Saumitou-I.aprade等,1991).萝细胞质雄性不育性可能同 o_,p6 基因有关,因为正常和不育胞质.印 6基因5端和编码区有差异(MakaroIt 等,1989). 也有人认为其不育性可能与不育系一段2.5kb的 NcoI 酶切片段有关,该片段有两个读框.棚弛和 o5s,其中 o38 只在不育胞质中转录,推测可以编码一个 16kI)的蛋白(Bonhomme 等,1992).珍珠粟不育胞质较多,其中 rm5,rrnl8 和 arxl 位点可能同 s-A 胞质不育性有关; 而6 则可能同其它类型的不育胞质不育性有关
23、(Rajeshwari 等,1994).烟草细胞质雄性不育和正常胞质呻以,call 以及.组织结构和转录有差异,且转录受核背景影响,估计可能与不育性有关(Haikansson 和 Glimelius,1991).菜豆细胞雄性不育性可能与不育系特异的一段 6,0kb 的 PstI 酶切片段有关.大豆细胞质雄性不育可能与 o,y9 有关 (等,1996);虾荑草不育和可育胞质线粒体 call,arxlll,nod 和 nmt2 基因区域差异明显(Potz,1993);胡萝 coxlll,had2,had3,唧 d 和泖 6 基因区域结构和转录不育和可育胞质均有差异(Seheike 等,1992),估计它们可能与各自的不育性有关.以上几种植物与其细胞质雄性不育有关的基因中,最有可能是雄性不育基因的是嵌合基因,尽管不同植物嵌合基因各不相同,但都有类似的结构,即有功能的 5调控区域通过重复序列与阅读框衔接.3 线粒体基因转录 RNA 与细胞质雄性不育3,1 线粒体基因转录的特点和分析方法植物线粒体基因组尽管只有部分序列能转录表达,但其转录情况相当复杂,因为基因组的过度重排,其基因转录往往有多个转录起始和终上位点,因而一个基因可产生
