1、妇血宁与氨肽素不连续体系 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳特征研究中国生化药物杂志 cllineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2003 年第 24 卷第3 期 135妇血宁与氨肽素不连续体系 SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳特征研究王爱军,王凤山,董丽宁,张天民(1.山东大学药学院生化与生物技术药物研究所,山东济南 250012;2.山东省莱阳生物化学制药厂,山东莱阳 265202)摘要:目的研究妇血宁与氨肽素及其片剂不连续体系 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDS.PAGE)特征差别.方法厢妇血宁与氨肽素及其片荆进行不连续体系 sDS.PAGE,并对其结果进行对比.
2、结果妇血宁及其片剂在整个泳道均有分布,在分子量大于 90000 和小于 20000 的区域染色较深,在泳道的最前端有至少 l 条明显的条带;氨肽素及其片剂成分主要分布在分子量小于 20000 的区域,在整个泳道无明显的条带;妇血宁和氨肽素与其相应的片剂电泳图谱没有明显的不同.结论在此 SDPAGE 条件下,妇血宁与氨肽素各有不同的电泳特征,可用于妇血宁和氨肽素及其片剂的鉴别.关键词:妇血宁;氨肽素;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中圈分类号:R978.16 文献标识码:B 文章编号:1005.1678(20o3)03.0135-02DisconflmmusSDS-PAGEcharacteristic
3、sof#g-hoofrdesVuxueningandAntaWANGAi-jun,WANGFeng-shah,DONGLi-ning2.ZHANGTianmin(1.InstituteofBiochemicalandBiotechnologicalDrug,SchoolofPharmacy.ShandongUniversity,Jinan250012,China;2.1_aiyangBiopharmaceuticalFactoryofShandongProvince,Laiyang265202,China)妇血宁与氨肽素均系以猪蹄甲为原料水解制备的多肽类药物,但所采取的工艺不同,药理作用与临床
4、应用也不相同.但目前二者均以其中蛋白质和氨基酸的一般反应作为其药品质量标准中鉴别与含量测定指标,不具有特异性,难以将两者区别.为此,我们分别对妇血宁与氨肽素及其片剂进行不连续体系 SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),找出它们的电泳特征,并建立对二者进行鉴别的方法.1 材料DY-600 型电泳仪,汕头市郊金砂广播仪器厂;DYY.III28A 电泳槽,北京六一仪器厂 ;SDS.PAGE 低分子量标准蛋白质(批号:0203),分子量范围为1440097400,中国科学院上海生物化学研究所监制;其他试剂均为国产分析纯.妇血宁(批号:020706,020716,020801),妇血宁糖衣片
5、(批号:011115,011204,020120),山东省莱阳生物化学制药厂生产;氨肽素(批号:20020508,20020509,20020610),氨肽素糖衣片(批号:20020518,20020619,20020621),丹东生物化学制药收稿日期;2002-09-23;.I固日期;2003-01.13作者筒介:王爱军(1977.). 男 ,山东成海人.硕士,主要从事蛋白质,核酸类药物研究工作.厂生产.2 方法2.1 供试品及对 Jll【品的配制2.1.1 原料药供试品配制分别取妇血宁 0.5g,氨肽素 1.0g,加水 1OIIll 溶解 ,过滤,取续滤液 1ml,用水稀释至 8IIll,
6、备用.2.1.2 片剂供试品配制分别取妇血宁糖衣片和氨肽素糖衣片各 5 粒,剥去糖衣,置研钵内研成粉末,称取 1.0g,加水 10IIll 溶解,过滤,取续滤液1ml.用水稀释至 8IIll,备用.2.1.3 低分子量标准蛋白质的配制取低分子量标准蛋白质 1 支,开封后加重蒸馏水 0.2ml 溶解,分装于 20 个小离心管中(每管 10),一 20保存.2.2SDSPAGE参照文献和中国药典)200o 年版二部附录 VF 中 SDS.PAGE 法,选择 17%浓度的分离胶对供试品进行分离,分离胶与浓缩胶的配制见表 1.供试品溶解液:SDS1g,巯基乙醇 1ml,溴酚蓝20I,蔗糖 40g,0.
7、05mol/LpH8.0Tris.HC1 缓冲液20IIll,加水至 100ml;电极缓冲液为含 0.6%Tris,2.88%甘氨酸和 0.1%SDS 的溶液;固定液:取 50%甲醇 454ml,冰乙酸 46ml 混匀;染色液:称取考马斯亮蓝 R2500.125g,加固定液 250ml,过滤后鲁用;脱l36 中国生化药物杂志 ChineseJournalofBiochemicalPharmaceufics2003 年第 24 卷第 3 期色液:冰乙酸 75rIll,甲醇 50rIll,加水至 l000ml.表 1 分离胶与浓缩胶的配制试剂名称配制 l7%分离配制 3%浓缩胶胶 l0ml 所需试
8、 l0IrIl 所需试剂剂体积(m1)体积 (m1)分离胶贮液(30%5.67Arc 一 0.8%Bis)分离胶缓冲液(pH8.9Tria-HC1 缓冲液)浓缩胶贮液(10%Arc 一 0.5%Bis)浓缩胶缓冲液(pH6.7Tris-HC1 缓冲液)l0%(w/v)SDS 溶液1%rEMED(v/v)重蒸馏水混匀后,置真空干燥器中,脱气 10min3.001.250.101.004.6o10%过硫酸铵溶液 0.050.05供试品处理与加样:取 1 支分装好的于一 20保存的低分子量标准蛋白质,室温融化,另取各供试品溶液 l0 于离心管中,各小管中均加入供试品溶解液 l0,加盖(不要盖紧以免加
9、热时进出),100oC沸水浴加热 3min,取出冷却后用微量进样器将小管中溶液取出加到供试品槽中.电泳:电泳开始时调整电压使电流为 10mA 左右,待供试品进入分离胶后调整电压使电流恒定为20mA.当溴酚蓝前沿距胶底边 1.5cm 时,关闭电源,停止电泳.?固定:将凝胶板取下放于大培养皿内,加入固定液,固定过夜,再取出凝胶板置另一培养皿内.染色与脱色:将染色液倒入盛有凝胶板的培养皿内,染色 1h 左右,用水漂洗数次,再用脱色液脱色,直至脱除背景颜色.3 结果与讨论妇血宁和氨肽素及其片剂电泳结果见图 1,2.从图 1,2 可以看出,妇血宁与氨肽素 SDSPAGE图谱明显不同,即妇血宁及其片剂在整
10、个泳道均有埘器绱43O003lO0020l0ol440o图 l 妇血宁与氨肽素 SDS-PAGE 图谱1.标准分子量蛋白质对照;24.氨肽素(批号:20020508,2O0205O9,20020610);57.妇血宁( 批号 :020706,020716,020801)Mr12345679766433l2014图 2 妇血宁与氨肽素片剂 SDS-PAGE 图谱1.标准分子量蛋白质对照;2一4.氨肽素糖衣片(批号:20020518,20020619,20020621);57.妇血宁糖衣片(批号:0l1115, 叭 1204,020120)分布,在分子量大于 90000 和小于 20000 的区域
11、染色较深,在泳道最前端有至少 l 条明显的条带;氨肽素及其片剂在泳道上呈不均匀分布,其成分主要分布在分子量小于 20000 的区域,在整个泳道无明显的条带;妇血宁和氨肽素与其相应制剂的 SDSPAGE图谱基本相同.因此,在本 SDSPAGE 条件下,妇血宁与氨肽素各有不同的电泳特征,在妇血宁和氨肽素及其片剂的质量标准中可增加电泳鉴别项目.参考文献:1朱希强,王凤山 ,张天民.猪蹄甲的药用概况J.氨基酸和生物资源,2OOO,22(2):43_46.2李建武,萧能愿 ,余瑞元,等.生物化学实验原理和方法M.北京:北京大学出版社.1994.218223.2003 年制药原料及中间体信息服务启事制药原料及中间体信息是目前国内唯一收集齐全的制药原料及中间体信息资料.它报道有关制药原料及中间体的全方位信息,包括医药政策法规信息,国内外新药研究开发审批情况,国内外市场,专利,企业动态及新工艺,新技术等.品种类涉及西药,中药,生物制品,化工原料及各种相关资料信息.欲购者联系电话:(010)68313344 3811一mlOll
