1、弓形虫病诊断技术的研究进展及其应用106 中国人兽共患病杂志 ChineseJournalofZoonoses2003,19(5)文章编号:10022694【2003)05010604弓形虫病诊断技术的研究进展及其应用周永安(综述),余新炳,陈观今(审校)中图分类号:R382.5 文献标识码:A弓形虫病是一种呈世界性分布且严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病.弓形虫是专性细胞内寄生的原虫,免疫功能正常的人群感染后多呈无症状带虫状态,但在免疫功能受损坏的患者,免疫缺陷者及先天感染者常导致严重的后果;孕妇感染可引起早产,流产甚至死胎;对于艾滋病患者,弓形虫是最常见的机会性感染原虫之一,常可导致严重的
2、并发症甚至死亡【.因此,对于弓形虫及弓形虫病的诊断的研究日益受到关注.传统的弓形虫病是以直接镜检,滋养体分离法,卵囊分离法和包囊分离等病原学的检查方法,此方法在过去近一个世纪弓形虫病诊断和预防中曾起重要的作用.但随着弓形虫病发病率的下降,抗弓形虫病药的广泛使用以及临床上的症状的复杂性,传统的病原学的检查方法费时,费力,亦由其特异性和敏感性的原因,常常导致诊断的错误,已越来越不能适应当前弓形虫病诊断及防治的需要.新的弓形虫病诊断方法主要在于提高敏感性和特异性,以及使操作更为简便,快速.大体可分为三类:一是免疫学的方法,主要利用单克隆技术使弓形虫病的检出率更简便,快速,如 ELISA,IHA和 I
3、FAT 等方法;二是主要以分子生物学为基础,通过分子杂交技术,DNA 体外扩增技术即聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)技术,从而大大提高检测的敏感性和特异性,如探针技术,PCRELISA 和巢式 PCR 等;三是 DNA芯片技术在弓形虫病诊断方面的应用前景.本文旨在近十几年来国内外实验研究和新诊断技术在弓形虫病诊断方面的研究进展临床应用及前景加以综述.1 以免疫学为基础的诊断方法随着细胞生物学技术,尤其是 1975 年 Kohler 和 Milstein创立杂交瘤单克隆抗体即以免疫淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交融合后制备单克隆抗体技术的发展,弓形虫病免疫学诊断研究
4、又有了新的发展.其中,用单克隆抗体,循环抗原等检测弓形虫的特异性的抗原,抗体,是目前弓形虫病免疫学诊断的主要临床检测手段,其类型有间接血凝:实验(IHA),免疫酶染色实验(IEST),ELISA 等,已普遍应用流行病学和临床诊断,具有良好的效果.吕元聪等用同一批血清对 IHA,IFAT,ELISA 三种血清学方法诊断弓形虫病进行了比较研究,结果 IHA,IFAT 和ELISA 检出的阳性率分别为 6.9%,8.5%和 15.4%,以ELISA 最为敏感.然后再用 ELISA 与 IHA 法进行特异性实验,在统一条件分别进行对照实验,重复实验和交叉实验,结果 ELISA 法有良好的特异性.认为每
5、种方法均各有优缺点,IHA 法的敏感性和特异性不如 ELISA,但该法简便,快捷,又有商品抗原供应,所以应用较广.1994 年吕元聪等以弓形虫碎片为抗原,建立免疫酶染色实验,检测 2O 份阳性兔血清和 52 份阳性人血清,阳性率分别为 100%和 96.2%;检测 2O 份阴性兔血清和 193 份阴性人血清,假阳性率 0 和1%;此法与血吸虫,肝吸虫病和疟疾均无交叉反应,说明对弓形虫有较高的特异性.另外,IEST 无需特殊设备,只需普通的玻片作载体,用普通显微镜判断结果,操作方法简便,实验成本低廉,便于基层推广和应用.Faust0【应用弓形虫单克隆抗体以 ELISA 法检测弓形虫溶解液,小鼠腹
6、水和急性病人血清.4 株单抗可检测出这些样本中的弓形虫抗原,而对照组呈阴性.但作者发现多克隆抗体比单抗检出的结果更令人满意.再者,单抗作为诊断试剂,虽有高度特异性,且易于标准化.但由于单抗识别特异性决定簇的特点可能导致缺乏足够的敏感性,所以实际应用中,可采用多个单抗混合的方法达到提高敏感性的目的.saI1t0r0 【4 将抗 P30 单抗吸附于载体上.用弓形虫膜组份过柱提纯 P30 抗原,以 ELISA检测 37 例急性弓形虫病患者血清,均含有高滴度抗 P30 的IgM 类抗体.因此,用纯化的 P30 作为诊断抗原有助于早期诊断.用此抗原检测恢复期患者血清,其敏感性比使用全虫抗原高出 2 个倍
7、比稀释度.目前,急性弓形虫病大多通过血清学方法检测抗体来诊断,然而特异抗体的出现可以延迟或不全,尤其是先天弓形虫病和免疫受损的患者,甚至可能不出现特异抗体.另一种方法是检测虫体的细胞组分或代谢产物,即循环抗原(tAg).ELISA 和免疫印迹实验(IBT) 方法用于检测弓形虫的特异循环抗原或抗体,目前应用的较广泛.I-Mid 等【6应用 ELISA 和 IBT 检测有不同血清学应答的孕妇和免疫受损病人中的循环抗原.结果表明,IBT 比 ELISA 的敏感性高,循环抗原的检测有助于弓形虫感染的诊断,尤其是免疫受损病人.另外,在免疫抑制状态下,弓形虫循环抗原的检测也有助于诊断.虽然弓形虫循环抗原(
8、cAg)阳性是确诊弓形虫病的可靠指标之一,但由于血清中 cAg 含量甚微以及现有的检测手段敏感性不够,故弓形虫 CAg 阳性率较低 L5.有学者在原有基础上加以生物素一亲和素系统,其灵敏度可提高百倍.目前已有多种改良方法广泛用于早期急性感染和先天弓形虫病的诊断.但是由于动物和人体感染的不同,弓形虫致病株的多样性和复杂性,至今循环抗原的诊断价值尚未定论.国内外有许多循环抗原的 ELISA 检测试剂盒,总的来说,国外生产的 ELISA 检测试剂盒质量较好,而国内ELISA 检测试剂盒除了有待于改进质量外,检验人员还应选作者单位:中山大学中山医学院病原生物学教研室, 广州 5100892003,19
9、(5)中国人兽共患病杂志ChingeJournofZoonoses107择多种试剂盒联合应用,以避免漏检和误检.2 以分子生物学为基础的诊断方法PCR 是近年来发展起来的一种快速的 DNA 片段扩增技术.它通过分别与双链目的的 DNA 序列两个 3 端互补的寡核苷酸引物结合,由 TaqDNA 聚合酶从 5 到 3 进行一系列 DNA 聚合反应,扩增出所需要的目的 DNA.PCR 技术自建立以来.因为它灵敏,特异,高效,简便,因此目前成为一项广为应用的诊断技术.80 年代末,DNA 探针检测弓形虫病的方法应用较多.它是用一定的示踪物对特定基因序列的核酸片段进行标记,通过与待测样本中互补片段的特异
10、性结合来进行诊断.根据所要求的目的不同,采用不同类型的核酸探针.1989 年Burg【等用针对 P 株弓形虫抗原的小鼠多克隆血清及寡核苷酸探针对 RH 株弓形虫基因组文库进行筛选,得到一个含2.2kbER 工基因片段的重组噬菌体,该片段在基因组中成串联式重复.应用不同长度的 B1 质粒和总基因组 DNA 进行定量 Souem 印迹分析结果表明 ,B1 基因重复 2550次.根据对每条带活性的更精确定量计算可知,在弓形虫基因组中 B1 基因拷贝数大约有 35 个.虽然 B1 基因产物的生物学功能还不十分清楚,但该基因是一种多拷贝基因且序列高度保守,高度重复的可作为弓形虫病 PCR 检测的目的基因
11、之一.stim【等以 kEM813 质粒构建弓形虫基因组文库.然后与放射性标记的弓形虫 DNA 杂交.经分析发现TGRIE 被认为是重复数最高且最为高度保守的 DNA 片段.Blan等 C8从弓形虫基因组 DNA 文库中筛选和分离出了一个在基因组中有近 1000 个拷贝的 440bp 片段,采用放射性同位素进行标记.以此为探针可检测 80pg 的弓形虫 DNA.Xia 等 C9以 1.1kb 的克隆 DNA 片段为探针,应用斑点杂交法检测,结果显示同位素 32P 标记的该克隆 DNA 片段特异性很高,并能检测低限为 500pg 弓形虫的 DNA,13 例标本呈杂交阳性的病例中.只要 5 例免疫
12、学检测阳性.后来人们用非同位素标记探针.大大拓宽了 DNA 杂交法的应用范围.Angd 等【10将 5 例怀疑有脑弓形虫病的艾滋病人的脑脊液标本的 DNA 抽提物点到硝酸纤维素膜上,用地高辛标记的特异性探针与之杂交,加底物显色后发现其中 4 例呈阳性.而用同样的探针检测分枝杆菌或其它病毒感染的脑脊液则全为阴性.还有许多研究者采用 rDNA 特异引物及其特异探针来检测弓形虫,也证明其有很高的特异性和敏感性.故而近来广泛应用.90 年代后,DNA 探针检测弓形虫病的方法逐渐被 PCR方法所替代的趋势,其原因可能在于 PCR 方法较探针方法简便,且敏感性和特异性均高.Fficker Hidalgoc
13、n等用PCR 技术,体内及体外培养法分别检测 94 份胎盘组织,结果发现,PCR 的敏感性高达 61%,而细胞培养和小鼠接种的敏感性分别为 29.6%和 51.5%,表明 PCR 较其它两种方法的敏感性高.Hoe1d12等用 B1 基因扩增检测先天性弓形虫病的产前诊断.结果表明,PCR 的敏感度为 97.4%.而常规的检测方法为 89.5%,并且操作简单,所需时间短.1992 年Rothu等通过 26 例艾滋病患者肺组织的 PCR 检测,发现 3例有弓形虫感染,阳性率为 12%,而显微镜检查则仅 1 例阳性.1991 年 Vmdeyen 等14以 B1 基因作为靶基因通过体外扩增检测临床不同的
14、病理组织和标本,并且与传统的弓形虫检测方法进行了比较,认为 PCR 方法是一种敏感,快速,特异的检测技术,对弓形虫感染的诊断是很有价值的理想手段.1993 年 DupouyCametit53 等以 P30 基因体外扩增检测艾滋病患者血标本,结果 14 例检测 8 例,阳性率较高.KhalifaKdS163 等用 PCR 方法检测 15 例艾滋病,发现其阳性率为 13.3%.血样标本的 P30 基因的检测,也可以诊断艾滋病病人播散性弓形虫病.将定量 PCR 与竞争 PCR结合不仅加强了质控而且还可估计患者的感染度.Bre+mgne17l18等采用此方法检测 121 例艾滋病患者标本中的弓形虫 D
15、NA,结果 12 例呈竞争性 PCR 阳性,而定量PCR 结果揭示虫荷与乳酸脱氢酶滴度有良好的一致性.弓形虫表面抗原 1722 基因用于临床孕妇产前诊断,56 份标本中检测出 3 例,认为该检测体系灵敏,特异,使用于孕妇弓形虫感染的诊断19. 另外,李爽等20j21 以直接法原位 PCR 检测感染小鼠弓形虫并与免疫组化法行比较,结果该法优于免疫组化法,灵敏性较高,能对虫体进行定位,并能观察组织的病理改变.作者又探讨问接法原位 PCR 在弓形虫病诊断中的价值.结果病原体的检出率为 100%,明显优于原位杂交.Hdd 等【22通过对骨髓移植患者的血清和各种组织进行PCR,巢式 PCR 及免疫组化方
16、法研究分析,认为 PCR 技术与免疫组化方法结合起来,才会更有效地发挥各自的优势,从而提高临床诊断的敏感性.为进一步提高 PCR 技术的敏感性和特异性,以及便于在临床工作中的推广,在 PCR 的基础上,近年来又发展了巢式 PCR(ntMPCR),PCRELISA 和 PCR 与探针结合的技术,并在弓形虫病诊断中得以应用.Fuent 髑【233 等首次报道以尿液进行婴儿先天性弓形虫病的产前诊断.作者选用巢式 PCR 进行诊断,结果表明,在婴儿先天性弓形虫感染的确诊中是一种非常有用的方法.1993 年 Guay24j 等报道 rDNAPCR 直接扩增虫体裂解液敏感度特别高,其敏感性达到可以检测到一
17、个弓形虫速殖子,在含有 10 人的成纤维细胞的 DNA 模版中可以检测到 10 个速殖子的效果.如果对扩增产物进行 Southern 印迹分析,那么其敏感度还能高上 100倍.陈观今等253 通过 PCR 扩增 RH 株 TGR4 核酸片段 ,扩增的产物经层析柱纯化后,用地高辛标记作为探针与待检测标本进行斑点杂交,结果特异性好,灵敏度可达到 lpg 水平的 DNA.此外,可通过比较 EB 琼脂糖凝胶电泳和 Southern印迹分析 PCR 阳性信号的强弱,可估计体内的弓形虫量,以此监控弓形虫病的疗效.GermanB 等26以 B1 基因体外扩增及 Southernblot 杂交技术检测了 56
18、 名免疫缺陷患者的眼房水和血液,结果有 16 例弓形虫 DNA 阳性.认为 PCR 检测对眼房水弓形虫病与眼房水疾病的鉴别是有用的,且可避免眼房水穿刺的问题.程玉芝等27应用 PcR/DNA 探针技术,直接检测白血病病人血液中弓形虫病原体 DNA,发现白血病患者中弓形虫 DNA 检测率为 15.8%.郑兰艳等 28应用 ELISAPCR 检测弓形虫循环抗原研究认为此方法是一108中国人兽共患病杂志ChineseJoumalofZoonoses种特异性强,敏感性高弓形虫的检测方法,其敏感性较ELISA 方法提高了 200 倍并且认为此方法检出阳性结果时间早等优点.另外,JoneS 等【2用 P3
19、0,B1 和 rDNA 三种靶序列来设计引物,通过套式 PCR 检测眼房水弓形虫 DNA 的方法来比较三者之间的敏感性.结果,无论是正常的眼房水还是有炎症的眼房水,仅有 B1 基因的引物保持 50 的水平,且也不会对真菌,细菌和人的淋巴细胞的 DNA 进行扩增.分别检测弓形虫脉络膜视网膜炎患者的眼房水或视网膜样本都能检测到虫体的存在.说明了以 B1 基因作为靶基因的 PCR 是最敏感的方法.Homan 等【3.鉴定出弓形虫基因组内有一个重复序列(重复次数为 200300 次,其单元为529bp),该序列具有高度的敏感性和特异性.作者以此为靶序列对患者的羊水和被感染的小鼠的各种组织进行检测,发现
20、此序列比 B1 基因敏感性更高.总之,由于巢式 PCR(nestedPCR),PCRELISA 和 PCR 与探针结合的技术等方法高度特异性和检测方法的高灵敏性,使得该技术成为在分子生物学领域内应用最广泛的基本技术之一,如果再和其它方法联合应用,其在 l缶床诊断应用则会更加广泛.3DNA 芯片技术DNA 芯片又称 DNA 微阵列(DNAnficroarray),基因芯片(genechip)等,是指用微阵列技术将大量 DNA 片段通过机器或原位合成以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃,硅等固相表面制成的高密度 DNA 微点阵.用荧光物质标记的探针,借助碱基互补原理与 DNA 芯片杂交,可进行大
21、量的基因表达及检测等方面的研究.DNA 芯片技术在基因诊断,表达,突变和发现新基因及各种病原体的诊断等生物医学领域中具有重大应用价值.DNA 芯片已在人类基因组研究如新基因的发现,EST组织特异性表达的快速筛选和功能研究(31,32,基因表达调控33,347,DNA 克隆绘图,基因多态性和同源性分析方面已捷足先登.目前已经有一些检测 p53 抑癌基因,HIV 逆转录酶基因,乳腺癌基因和囊性纤维病基因的诊断性基因芯片面世.由于核酸微阵列技术操作简便,且能在一次实验中同时快速,敏感地检测成千上万个基因,结果检测分析也可实现自动化,因此获得的信息高度特异,稳定,它被誉为遗传信息分析革命性的里程碑.它
22、的特点同样也为其在寄生虫研究领域的应用提供了广阔的前景.可以预见,随着弓形虫分子遗传学的研究的进展和弓形虫核酸微阵列技术的研究开发,相信在不久的将来 DNA 芯片在弓形虫病的基因诊断方面会有更诱人的前景.4 结语综上所述,弓形虫病诊断新技术的发展,为弓形虫病学研究及其疾病的诊断的实施提供了许多可供选择的方法.传统的显微镜镜检方法普及性和稳定性较高,在目前条件下尚难以其它方法全部替代之;单克隆抗体一 ELISA 虽在大样本的检测中花费最少,但其稳定性较差;PCR 技术仅经数年便以惊人的速度广泛应用医学和生物学各个领域,并且在此基础上衍生了多种疾病的检测技术.这些特异,敏感,准确的技术已在弓形虫病
23、学领域逐渐开展和应用,;其广阔的前2003,19(5)景.但由于对实验室要求条件较高且具有经过严格训练的专门技术人员才可上岗,有其一定的局限性.因此,在弓形虫病的诊断方面,传统诊断应与其它新的诊断技术取长补短,相互补充,才能在弓形虫病的诊断中发挥其应有的重要作用.参考文献1LuftBJ,Remington.ToxoplasmicencephalitisinAIDSJ.ClinInfDis,1992,15:211.2吕元聪,郑挺 ,崔君兆,等.免疫酶染色试验诊断弓形虫感染的初步研究J.预防医学情报杂志,1994,10(1):24.3FaustoG,ArauJO,EmanuelaHandman,e
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