1、超声提取-固相萃取-高效液相色谱法测定火腿肠防腐剂含量的方法摘要:针对火腿肠食品特点，对液相色谱法测定火腿肠中苯甲酸、山梨酸的样品处理方法进行研究，建立了有效的高效液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量的样品处理方法。关键词：火腿肠食品特点;高效液相色谱法;测定；防腐剂含量1、 引言火腿肠是深受广大消费者欢迎的肉类食品,为防止食品变质，生产厂家常在火腿肠中加入防腐剂。我国目前常用食品防腐剂主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐为主。火腿肠中苯甲酸和山梨酸的测定样品处理方法，在国标GB/T5009. 29 - 2003中苯甲酸、山梨酸测定的液相色谱法中，只规定了饮料和配制酒样品处理方法，其它样品处理
2、没有提及。火腿肠食品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基质成份较多,并且苯甲酸、山梨酸具有脂溶性的性质决定了样品处理的复杂性。本文针对火腿肠食品特点，对液相色谱法测定火腿肠中苯甲酸、山梨酸的样品处理方法进行研究，建立有效的高效液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量的样品处理方法。2、 实验2.1仪器与试剂2.11仪器2台LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪（配置LC-10Tvp高压恒流泵）；一台SPD-10Tvp紫外检测器；一台SCL-10Tvp 系统控制器；一套 7725i手动进样阀；一套色谱工作站（VI2010，N2000，N3000选用）；液相色谱柱：1支 （C18 4.6*250mn，5um）；微
3、量进样器：1支 （50ul/100ul）；进样支架 ：1只 （进样阀用）2.12试剂火腿肠市售。苯甲酸(分析纯，99.5%)、山梨酸(化学纯，99.0%)、乙酸铵(分析纯，98.0%)、乙酸铅(分析纯，99.5%)溶液(379.33g/L)国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯，99.9%)、三次去离子水。2.2方法2.2.1标准贮备液的配制分别称取山梨酸0.1000g，苯甲酸0.1000g，加入8ml20g/LNaHCO3溶液，定容于100ml容量瓶，配成1.0mg/ml标准贮备液。2.2.2色谱参数和条件岛津色谱柱VP-ODS(250mm4.6mm，5m)；进样量：20l；检测波长：230
4、nm；灵敏度0.02AUFS。2.2.3样品制备超声提取称取2.0g火腿肠，经研钵研碎后置于25ml比色管，加5ml水，经80水浴加热30min后，超声提取30min，以10000r/min高速离心5min，取上清液至25ml容量瓶，定容至刻度。固相萃取净化：取C18SPE固相萃取小柱依次用5ml甲醇和3ml水活化后，再通过5ml样液，用5ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，再用5ml水以一定的速度洗脱，收集洗脱液2.5ml容量瓶，经过0.45m滤膜过滤后，用HPLC分析。3结果与分析3.1色谱条件的优化3.1.1流动相的组成及配比的选择流动相是色谱分离中十分重要的影响因素，直接关系到分析的灵敏度、检出
5、限，决定着能否将样品的组分洗脱分离。苯甲酸、山梨酸在不同的组成及不同的比例时的分离效果，由表1可见，流动相为0.02mol/L乙酸铵:甲醇体积比为95:5时的分离效果好。3.1.2流速的选择本实验分别选择0.8、1.0、1.2ml/min作为流动相的流速，结果显示，流速为1.0ml/min时洗脱的山梨酸和苯甲酸的量，比1.2ml/min时的多，并已能较为完全的洗脱，分离效果理想，不干扰测定；而选择0.8ml/min作为流速，则分析时间过长。综上述情况，选择1.0ml/min作为流动相的流速。3.2标准曲线绘制及相关系数测定分别移取1.0、2。0、3.0、4.0、5.0ml 1.0mg/ml的苯
6、甲酸、山梨酸标准贮备液于50ml容量瓶，用水定容至刻度，配成浓度分别是20、40、60、80、100mg/L的标准溶液，经0.45m滤膜过滤后，取20l注入色谱仪，测定峰面积，以峰面积对浓度(mg/L)作标准曲线。苯甲酸线性方程为y=2867x+876.78，相关系数0.9986；山梨酸线性方程为y=4469.9x+1928.6，相关系数0.9989。本法苯甲酸和山梨酸在20100mg/L范围线性很好。3.3样品前处理方法的优化3.3.1样品净化方法的选择用水提取的样品液中杂质非常多，含有较多的水溶性蛋白质，如果不进行净化而直接进行液相色谱分析，将严重影响色谱柱的使用寿命。殷茂荣等8采用添加蛋
7、白质沉淀剂的方法对样品进行净化。分别采用以C18SPE小柱和加入乙酸铅(379.33g/L)作为蛋白质沉淀剂两种方法净化样品，乙酸铅的加入量为3ml。实验结果表明，经过C18SPE小柱净化山梨酸提取量为22.706mg/L，乙酸铅作为蛋白质沉淀剂净化山梨酸提取量为17.202mg/L。采用乙酸铅作为蛋白质沉淀剂，会对山梨酸造成损失。因此，本实验选择固相萃取方法净化样品。3.3.2洗脱流速由于C18SPE小柱对目标物有吸附作用，因此洗脱液的流速对洗脱量也有影响，实验发现减慢流速可增加洗脱量，经实验，选择以1.0ml/min的洗脱速度洗脱。3.3.3防腐剂提取方法的选择分别称取3份2.0g火腿肠与
8、25ml比色管，加5ml水于80水浴30min，标号1、2、3将1号比色管置于80恒温水浴中，加热30min，2号比色管超声30min，3号比色管于水浴恒温振荡器中振荡30min，按2.2节所述色谱条件进行分析，每种提取方法平行测定3次。表2结果显示，超声提取的提取量高于加热和振荡提取。3.3.4超声提取时间取4份2.0g火腿肠于25ml比色管，分别标号1、2、3、4.各加5ml水，于80水浴加热30min，1号超声10min，2号超声20min，3号超声30min，4号超声40min，按照2.2.3方法进行分析，结果见表3，显示超声提取30分钟效果较好。3.4.检出限以样品被测组分峰高为基线
9、噪音3倍时的浓度为最低检出浓度，苯甲酸的检出限为1.47g/kg，山梨酸的检出限为0.86g/kg。3.5加标回收率实验不同加标水平的苯甲酸、山梨酸的回收率为101.79%105.28%，其相对标准偏差小于等于1.84%。3.6样品测定由图1可见，市售火腿肠中山梨酸(SA)的含量为22.706mg/L，但没有检测出苯甲酸，且经净化后的样品所含杂质对被测组分的干扰较小。4结论采用超声提取-固相萃取-高效液相色谱法测定实际样品，预处理步骤简单，使用C18SPE小柱进行样品净化，有效去除了样品中的杂质；用超声的方法提取样品中的防腐剂，避免了使用有机试剂提取对操作人员的健康造成危害；且分离效果好、线性范围宽、重现性好、灵敏度高，完全能满足分析要求。、-
