1、1绿豆根尖基因组 DNA 不同提取介质的比较探究郑妙燕 科学一班 20042501029（华南师范大学 生命科学学院 广东 广州 510631）摘要： 本文通过用同种方法不同提取介质提取绿豆根尖基因组 DNA，比较两种提取介质的提取效果。关键词：绿豆根尖，基因组 DNA，提取介质前言：随时基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物 DNA，用于构建基因文库、基因组 southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。提取基因组 DNA(genomicDNA,gDNA)是多种分子生物学实验的第一步，是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作
2、，有效地完成 DNA 提取工作，是进行分子生物学深入研究的前提；而提取 DNA 的产率和质量将直接关系到实验的成败。目前国际上已有许多 DNA 的提取方法，但由于分子生物学方法的不断改进，各种试剂盒的市场化，以及生物的多样性和复杂性，选择一个简便、快速又价廉的 gDNA 提取方法或试剂盒，且能得到某物种高产率和高纯度的 DNA，针对性的进行 DNA 提取条件的优化有一定的意义。本实验对绿豆根尖基因组 DNA 不同的提取介质进行探究，以找出提取效果较好的介质，达到提取条件优化的目的。对 DNA 提取所需的提取介质的选择有一定意义，从而对此类分子生物学实验研究有所助益。1. 实验材料、试剂和仪器1
3、.1 实验材料：绿豆根尖，Marker1.2 实验试剂：4多聚甲醛，巯基乙醇，KAc，苯酚，氯仿，异丙醇，无水乙醇，EDTA，CTAB，NaCl ，Tris ，11.7mol/LHCl，-巯基乙醇，EDTA-Na 2，SDS，琼脂糖，TE 缓冲液，重蒸水，1.3 实验器材：离心机，离心管，移液枪，分光光度计，石英比色皿，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，制胶板，紫外透射仪22. 实验步骤：2.1 剪取绿豆根尖（长约 1cm） ，用 4多聚甲醛固定 4 个小时，放于冰箱内保存。2.2 取 1.5g 根尖平均放于研钵中，分别加入 1ml DNA 提取液 SDS 和CTAB、3.5ul 巯基乙醇充分研
4、磨后，于 65水浴锅中充分水浴提取 1 h。2.3 取出后于 4，10000rpm 条件下离心 5min，取上清加入 300ul 预冷过的 KAc，置于冰盒中 0.5 小时。2.4 于 4，12000rpm 条件下离心 10min，取上清液，加入等体积的苯酚：氯仿：异丙醇（25：24：1） ，放置 10min。2.5 于 4，12000rpm 条件下离心 10min，取上清加入 2 倍体积以上的无水乙醇，并置于-20 中 3 个小时。2.6 于 4，13000rpm 条件下离心 20min，弃去乙醇后，用 70乙醇洗涤1 次，最后置于空气中让其自然干燥或者用风筒吹干。2.7 根据沉淀多少，用
5、20ul-40ul 含有 RNA 酶的 TE 缓冲液溶解，并置于-20 冰盒中保存备用。2.8 分别用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法对 DNA 提取物进行浓度和纯度的检测。2.9 从所提取的 DNA 的浓度、纯度和结构完整性进行比较，以鉴定两种提取介质的提取效果。3. 结果与分析分光光度值OD 值 260 280 OD260/OD280CTAB 0.007 0.006 1.167SDS 0.054 0.050 1.080DNA 样品的浓度（CTAB）：0.00710050/1000=0.035g/lDNA 样品的浓度（SDS）：0.05410050/1000=0.27g/l从分光光度法的结果
6、可以明显地看出，提取到的 DNA 都有污染，而且OD260/OD280 都小于 1.6，证明有蛋白质、酚等污染。我们提的 DNA 呈现出白色，应该是蛋白质没有抽提干净。如果是是棕褐色，则可能是由于多酚类物质氧化3所致。从浓度来看，很明显可以看出用 SDS 提取介质提取的 DNA 样品浓度比较高，但是因为两者都有污染，样品不纯，比值发生变化，不能用分光光度法对 DNA 进行定量比较。但据查到的资料记载，CTAB 法简便快速，DNA 产量也高，这可能是因为本次药品的配制出现了一点问题，此问题尚须进一步研究。如果要考虑药剂是否配得准确无误的话，应该整个实验从配药品全部重新做重复实验。本次实验我们的电
7、泳结果并没有跑出带来，具体原因有可能是：1、DNA的提取浓度不高；2、TE 缓冲液配错；其中最主要的原因就是 TE 缓冲液的问题，因为我们所加的 TE 缓冲液是偏酸性的，加进载样液后溶液不是显蓝色而是显示绿色，后来找到原因时我们采用了将胶板反过来放，即将点样孔朝向正极，但是还是没跑出带，可能是荧光染料在光下已经分解了。从做得好的小组的结果可以看出，提取到的 DNA 跑出了一条带，而且在 Marker 前面。因为植物样品没有经液氮处理，所以提取液 CTAB 浓度需要达到4%（W/V ） 。在许多情况下，使用 0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限
8、制性内切酶的活性，如果巯基乙醇浓度高过 0.1%（V/V） ，则会大大降低 DNA 的提取率。因为提取液中含EDTA，能够螯合 Mg2+等二价阳离子，防止破碎细胞中的 DNA 酶降解 DNA，所以在研磨时直接加入提取液研磨。制备的 DNA 在（1）含有螯和剂如 EDTA 中较稳定，因为 EDTA 能螯和Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase；（2）在 pH5 9 之间较稳定，否则过酸过碱会破坏 DNA 的结构；（3）有一定离子强度（强度越高, DNA 越稳定）的溶液中较稳定。整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴） ；这样可防止和抑制内源 DNase 对 DNA 的降解，保证植
9、物 DNA 的完整性。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组 DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的 DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的 DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组4DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。CTAB 法是一种快速简便的提取植物总 DNA 的方法，其原理是：采用机械破碎植物细胞，然后加入 CTAB 分离缓冲液将 DNA 溶解出来，再经氯仿异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到
10、DNA。CTAB 是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的( 一定浓度的 CTAB)溶液中沉淀核酸(与核酸结合并通过离心形成CTAB核酸复合物沉淀)和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB 与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB 可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括 E.coli 的某些株）中制备纯化 DNA 。 SDS 是离子型表面活性剂的一种( 阴离子去垢剂)，对蛋白质有强烈的变性作用，使其解折叠为单条肽链，并在蛋白质表面覆盖大量负电荷，即消除了蛋白质分子之间电荷差
11、异(与蛋白质结合，形成 SDS-蛋白质复合物)。4. 参考文献1 李学英，王大忠，王乾兴. 一种改进的鲇鱼 (Silurus asotus and Silurus meridionalis)基因组 DNA 的高效提取方法. 遵义医学院学报，2001,(1):19-21.2 卢圣栋. 现代分子生物学技术. 北京：高等教育出版社，1993,89-130.3 许秀珍，梁山. 生物化学与分子生物学实验指导. 暨南大学出版社，2003,122-127.4 黄晓丹，张云贵，应铁进. 高质量植物基因组 DNA 的提取. 植物生理学通讯，2006,42(2):311-314.5 乌云塔娜，张党权，谭晓风. 梨不同 DNA 提取方法的效果研究 . 中国生物工程杂志，2005,15(5):41-43.6 陈惠云，孙志栋，茅轶俊，王晓武，葛红. 春兰基因组 DNA 提取方法的研究. 分子植物育种，2006,4(1)135-142.7 杜道林，马文儒，苏杰，周鹏，郑学勤. SDS、CTAB 和 PVP 法提取香蕉基因组 DNA 的比较研究. 海南师范学院学报，2003,16(1).74-80.
