1、改良组织块法大鼠成骨细胞培养的研究?540?四川医学 20o4 年 5 月第 25 卷(第 5 期)SichuanMedicalJournal,2004,Vo1.25,No.5改良组织块法大鼠成骨细胞培养的研究唐孝明,万伦,刘仲前,裴福兴.胡豇(1.四川省人民医院,四川成都 6l0072;2.四川大学华西医院,四川成都 610041)【摘要】目的采用改良组织块法进行大鼠颅骨成骨细胞的体外培养.方法将新生sD 大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净后剪成碎块.0.25%胰蛋白酶消化 20 分钟,碎骨块接种于培养瓶中培养,从形态学,碱性磷酸酶染色等方面鉴定.结果培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱
2、性磷酸酶呈阳性染色.结论改良组织块法培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞形态特征,成分较单一.【关键词】成骨细胞;细胞培养【中图分类号】R329.2【文献标识码】B【文章编号】10040501(2004)0554003很多,但其对纵隔淋巴结诊断的敏感性和特异性却未增加,对非小细胞肺癌(NSCLC)的术前分期存在高估(overstaged)和低估(downstaged)的情况 l-lJ,评价上纵隔淋巴结的状态,纵隔镜的诊断价值已被广泛接受,而胸腔镜并不是一个标准的分期工具 l-2J.CT 对纵隔淋巴结诊断的敏感性和特异性分别为 52%和 69%,假阳性率 50%,假阴性率 20%l-3J,Kemst
3、ine 报道灵敏度,特异度,准确率分别为 65%,79%,76%l-4J,本组病例 cT 对诊断纵隔淋巴结转移的灵敏度为 63.6%,特异度为70.6%,假阳性率 29.4%,假阴性率 36.4%,结果与其相似,阳性预测值 58.3%,而 Kiernan 的报道是 80%,阴性预测值 75%,与 Gurses 报道的 76.5%接近 5J.CT对 N 分期的准确率仅为 47%,甚至有人主张对所有NSCLC 的病人均应常规作纵隔镜检查 ,但尚存争议 l-6.纵隔淋巴结转移是影响预后不利因素,尽管 CT为治疗前的分期提供了极有价值的证据,但仍然不能取代纵隔镜的诊断价值,王俊报道电视纵隔镜在肺癌术前
4、分期的准确性,敏感性和特异性均达到了100%l;Freixinet 报告灵敏度 81.2%,特异度 100%,阳性预测值 100%,阴性预测值 91%l8l,本组灵敏度95.2%,特异度 100%,纵隔镜诊断纵隔淋巴结 8 例为淋巴结炎性反应,术后病理证实其中 1 例纵隔淋巴结转移,分析原因可能为取材太少所致.准确的分期对治疗方案的制定和选择有直接的指导意义.根据 1997 年国际抗癌联盟(TNM)NSCLC 分期,纵隔淋巴结(N2,N) 有无转移决定 ma 期或 mb 期,ma 期的治疗趋势是行新辅助化疗后再手术,Ib 期则考虑放疗+化疗 j,所以对于肺癌的综合治疗方案的制定是十分重要的.一
5、些高风险手术如肺癌扩大切除术,术前更应以纵隔镜评估纵隔淋巴结状态,减少探查率和姑息性切除,避免对病例行姑息性的全肺切除.本组 16 例 ma 期 NSCLC 行新辅助化疗 23 个周期后手术,取得了较好效果.纵隔镜判断左肺癌右纵隔淋巴结转移达到 100%l-3J.电视纵隔镜的最佳检查区域是中纵隔,局限是不能达到后纵隔和下纵隔,这是和 CT 比较的局限性,对该区域的活检可由胸腔镜完成;扩大的纵隔镜检查术由 Ginsberg 在 1984 年首先报告,一般只有 CT 显示第 5,6 组淋巴结肿大,而颈部纵隔镜检查术阴性,才行该术式,该术式可以达到前纵隔.取 5,6 组肿大的淋巴结 l6,8J.通过
6、对电视纵隔镜和 CT 的诊断性试验进行分析和评价,可以得出结论,电视纵隔镜对 NSCLC 术前分期的灵敏度,特异度,阳性预测值和阴性预测值都大大高于 CT,对 NSCLC 的综合治疗方案的制定非常重要.参考文献:1王火强,苗积生 ,吴吉勇等,18FFDGSPECT 显像对非小细胞肺癌淋巴结转移及其分期的研究J.中华核医学杂志,2OO2,22(1):26272EggelingS,MartinT,BottgerJ.InvasivestagingofnonsmallcdllungcanceraprospectivestudyJ.EurJCardiothoracSurg,2002,22(5):6796
7、843杨士力.电视纵隔镜的检查方法J.中国内镜杂志,20O2,8(8):31334KernstineKH,StanfordW,MullanBF.PET,CTandMR1withcombidexformediastinalstaginginnonsmallcelllungcarcinomaJ.AnnThoraeSurg,1999,68(3):102210285GursesA,TumaA,BirhanMA.11levalueofmediastinoeopyinprop.erativeevaluationofmediastinalinvolvementinnon?,small?,celllungca
8、rlc:rpatientswithclinicalnodiseaseJ.ThoraeCardlovascSurg,2OO2,5O(3):1741776王俊,赵辉 ,等.纵隔镜术及其在肺癌分期中的应用价值J.中华胸心血管外科杂志,2002,18:1901927王俊,赵辉 ,刘军,等.电视纵隔镜临床应用的初步体会J.中华外科杂志,2002,40:8408428FreixinetGilartJ,GafiaPG,deCastroFR.Extendencervicalmedi.astinoscopyinthestagingofbronchogeniccarcinomaJ.AnnThoraeSurg,20
9、00,70(5):164116439王欣,王植蕃 ,戎铁华,等.纵隔镜的诊断价值及其在肺癌分期中的应用J.中华肿瘤杂志,2002,24:7476(收稿日期:2003.10-21)四川医学 20O4 年 5 月第 25 卷(第 5 期)SichuanMedicalJoztrnal,2004,Vo1.25,No.5?54l?随着细胞生物学技术的发展,成骨细胞培养已成为研究细胞生理,骨质疏松发病机制及其治疗药物筛选的重要手段.本研究应用改良的组织块法,体外分离培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,并从细胞形态学,碱性磷酸酶染色等方面予以鉴定,现报告如下.1 材料与方法1.1 成骨细胞的培养:新生 SD 大鼠(
10、35 天),75%酒精消毒 5 分钟后处死,无菌取颅骨,置于含有 DMEM的培养皿中,手术放大镜下仔细剔除骨内,外膜及骨缝间组织,Hanks 液反复浸泡,洗涤 3 次,将骨块修整为l2mm 大小碎块,再用 Hanks 液反复洗涤至无血性成份.用 0.25%胰蛋白酶在 37消化 20 分钟;中止消化后,用弯吸管吸取碎骨片,均匀接种于 25ml 的培养瓶中,翻转培养瓶置 37体积分数 5%的孵箱中 23 小时,转正培养瓶并加入含有 20%小牛血清的DMEM 培养液后继续培养,3 天后换液,7l0 天后待细胞融合成单层后再传代培养.1.2 成骨细胞显微结构观察:对培养的原代细胞,每天用倒置显微镜观察
11、并逐日摄像纪录.1.3 成骨细胞透射电镜观察:取第二代培养的成骨细胞以 5104 接种于 25ml 培养瓶中,待细胞长满以后,以细胞刮除刷从瓶壁收集细胞于 EP 管中.用 Hanks液冲洗,4000rpn15 分钟离心,弃上清液,再加人0.2%戊二醛固定液混悬固定 30 分钟;10000rpn15分钟离心,弃上清液,加入 2%戊二醛固定备用.标本先用 3%戊二醛预固定,l%锇酸再固定,然后丙酮级脱水,Epon812 浸透包埋,超薄切片,铅.铀双重染色,H600 一型透射电镜观察摄像.1.4 成骨细胞碱性磷酸酶(偶氮偶联法)染色:将原代和第 23 代成骨细胞以 5104 个/孔接种于预置盖玻片的
12、 6 孔板,待细胞长满后,取出盖玻片用 PBS 液冲洗.盖玻片在 95%乙醇固定 23 分钟,PBS 液冲洗凉干.再滴加新配制的基质液,在 37下孵育 30 分钟.按下述方法报告:计数 200 个细胞,先计数有几个阳性,算出阳性百分率.2 结果2.1 成骨细胞显微结构观察:相差显微镜下培养第 3天可见成骨细胞自颅骨碎片移出,呈短梭形或三角形,生长于瓶底;培养第 5 天,移出的细胞明显增加,以骨块为中心,向周围呈放射生长;培养的第 78 天,细胞融合成单层.传代细胞在 6 小时内贴壁,细胞形态为长梭形,鳞片形,短梭形,圆形.细胞周围有半透明光晕,胞浆内常可见许多大小不一的深色颗粒散布核周,胞核椭
13、圆居中.轮廓清晰,核内 l2 个核仁,细胞突起细长,常跨越细胞与远处的细胞突起相连接.长满瓶底时,细胞为梭形及立方块状,排列紧密,并可见圆形或鳞片形细胞.随着培养时间的延长,可见成骨细胞呈多层生长.2.2 成骨细胞超微结构观察:电镜下,成骨细胞具有典型特征,胞浆内富含大量的粗面内质网,线粒体等细胞器,胞核较小,核浆比例也较小.2.3 碱性磷酸酶染色:染为紫色者为阳性细胞.原代细胞阳性率为 78.6%,阳性细胞多为梭形和鳞片形细胞.随着传代次数的增多,阳性细胞率随之增加,第 23 代阳性细胞率分别为 89.5%和 92.1%.3 讨论20 世纪 60 年代,PeckIJ 等首先使用胶原酶消化骨片
14、,并通过体外培养成骨细胞取得成功,1975 年,Wong.】等使用胶原酶多次消化鼠的颅盖骨 ,使成骨细胞得到进一步纯化,1985 年,RobeyJ 等采用低钙培养液培养骨片获得人的成骨细胞,并使之进一步纯化.目前,成骨细胞的培养方法主要有酶消化法和组织块法.酶消化法虽然可获得大量的细胞,但用多种酶对组织进行消化,分离收集细胞时,步骤复杂,在消化分离过程中细胞损伤大,可影响细胞的贴壁率和成活率,且操作过多易污染;而组织块法则相对简单,污染机会少,可以获得较纯的细胞.本实验中,我们采用改良的组织块成骨细胞分离培养方法,先用 0.25%的胰蛋白酶消化去除成纤维细胞,并松解成骨细胞,然后,利用成骨细胞
15、具有游走的特性 J,将新生大鼠颅骨碎片贴附于培养瓶底,让成骨细胞从颅骨碎片表面游出,生长于培养瓶底上.为避免细胞间的污染,还采取以下措施:手术放大镜下仔细剔除颅骨骨内,外膜,骨缝连接处组织以及可疑组织一律除去;Hanks 液反复冲洗,去除组织块表面的非粘附细胞;胰蛋白酶消化20 分钟,去除组织块表面残留的血细胞,成纤维细胞,骨髓细胞,破骨细胞;新生大鼠颅盖骨为板层骨,几乎没有髓腔和小血管,因此混杂内皮细胞的数量相应很少.本研究培养的成骨细胞呈贴壁型生长,形态多为梭形或鳞片形,胞浆透明,单个核,核仁 l2 个,具有多数学者报道的成骨细胞的形态特征6J,培养物中未见其他形态的细胞污染.透射电镜下,
16、其胞核较幼稚,胞浆内含大量的粗面内质网,线粒体,表现出旺盛的分泌功能,这是电镜下与成纤维细胞等区别的重要特征.除形态学观察外,还可通过检测成骨细胞特征性的分泌物鉴别成骨细胞,碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化的早期特征,其表达随着细胞分化的发展而增强,其作用是水解磷酸酯以释放出无机磷,增加其?542?四川医学 2004 年 5 月第 25 卷(第 5 期)SichuanMedicalJournal,2004,Vo1.25,No.5陈旧性胸腰椎骨折后凸畸形的原因分析万仑,唐孝明,刘仲前,胡豇(四川省人民医院,四 JlI 成都 610072)【摘要】目的研究陈旧性胸腰椎骨折后凸畸形发生的原因.方法
17、回顾性分析从1999 年 1 月至 2003 年 1 月在我院治疗的陈旧性胸腰椎骨折后凸畸形的病人 5l 例 .结果 51 例中 36 例(70.6%)为内固定术后病人,前路减压植骨内固定术后 l5 例,后路减压内固定术后 2l 例,内植物松动 7 例,植骨未融合 8 例;非手术治疗 15 例(29.4%),其中 11 例卧床休息的时间为 34 周,4 例卧床休息时间为 45 周.结论手术处理不当是陈旧性胸腰椎后凸畸形发生的主要原因,后路减压内固定较前路减压植骨内固定更易发生后期后凸畸形,对稳定的胸腰椎骨折,卧床休息的时间应延长至 6周,同时加强腰背肌的功能锻炼,继以腰围或保护性支具外固定 7
18、 周.【关键词】胸腰椎;骨折;后凸畸形【中图分类号】R681.5【文献标识码】B【文章编号】10040501(2004)05542.02自 1999 年 1 月至 2003 年 1 月,我院骨科共收治陈旧性胸腰椎骨折后凸畸形 51 例.通过临床资料的回顾性分析,总结该病发生的原因,并提出预防措施.1 临床资料1.1 一般资料:51 例中,男 38 例,女 13 例;年龄 2361 岁,平均 54 岁.随访 624 个月,平均 11 个月.骨折部位:Tll3 例,Tl218 例,Ll20 例,5 例,Tll,Tl23例,Tl2,Ll2 例.类型:压缩骨折 21 例,爆裂骨折 18例,骨折脱位 8
19、 例,Chance 骨折 4 例.内固定选择:zplate 钢板 9 例,前路钉棒系统 6 例,Dick 钉 12 例,RH5 例,USS4 例.1.2 陈旧性后凸畸形发生情况:51 例中 15 例为非手术治疗,占 29.4%,均为无神经损害患者;非手术治疗患者中 11 例卧床时间为 34 周,4 例卧床时间为 45 周;12 例椎体压缩为 50%,3 例压缩 30%.36 例为手术治疗,占 70.6%,其中前路减压植骨内固定 15 例,内固定松动 2 例,植骨未融合 3 例,后路减压内固定 21例,内固定松动 5 例,植骨未融合 5 例,见表 1.表 1 后期后凸畸形发生情况注:A(保守治疗
20、),B( 前路减压植骨内固定),c(后路减压内固定)2 讨论2.1 手术处理不当是陈旧性胸腰椎后凸畸形的主要原因:本研究中,70.6%的陈旧性胸腰椎后凸畸形的患者发生于术后,29.4%的后凸畸形发生于前路减压植骨融合患者,41.6%的后凸畸形发生于后路减压内固定患者.手术复位不满意,脊柱矢状面形态没有重建,内固定不可靠,后路切除减压时不行内固定和植骨融合均可导致后期后凸畸形,有研究表明,单纯的椎板减压会破坏脊椎后部结构的稳定性,造成医源不稳,不但起不到神经减压的作用,而且会导致脊椎的后凸畸形,3J.本研究的 51 例后凸畸形患者有 21 例局部浓度,促进基质矿化,大量分泌 ALP 是成骨细胞的
21、另一特征,ALP 有不同组织分泌的多种同工酶,检测其骨特异属性同工酶,可作为鉴别成骨细胞的标准,本研究培养的成骨细胞 ALP 染色呈阳性反应,证实该细胞具有 ALP 活性,符合成骨细胞的生物特征.参考文献:1PeckWA,BirgeST.Bonecells:biochemicalandbiologicalstudiesafteren-zymatieisolationJ.Science,1964,146:174617502WongGL,CohnDV.Targetcellsinboneforparathormoneandcalcitoninaredifferent:enrichmentforeac
22、hcelltypebysequentialdigestionofmouseealvariaandselectiveadhesiontopolymericsurfacesJ.ProNatlAeadSciUSA.1975.72:316731713RoboyPG,TermineJD.HumancellsinvitroJ.CaleifTissuelnt,1985,37:453460.4JoneSJ,BodyA.ThemigrationofosteoblastJ.CellTissueRes,1997,184:1795MariePJ,Aborrahimlomri,Aymansabbagh,eta1.Cultureandbehavionofosteoblasticce11sisolatedfromnormaltrabeeularbonesuffaeeJ.InVitro1989,25:2732796BettinaA,HauschkaPV,SchwaItzER.CharacterizationofhumanbonecellsineuhureJ.CalcifTissueInt,1985,37:2282347WlodatskiKH.PmpertiseandoriginofosteblastsJ.ClinOrthop,1990,252:276279
