1、地塞米松对哮喘患者外周血单个核细胞p38MAPK 表达的影响壁!兰堕兰望兰坚! 箩 19 卷第 2 期J.umalofXianningCollege(M.dialSci.n.)89地塞米松对哮喘患者外周血单个核细胞 p38MAPK 表达的影响黄翠萍,赵辛元,张珍祥,谢模英,徐旭燕,郭衍坤,李德玲(1.成宁学院附属第一医院内科,湖北成宁 437100;2.华中科技大学附属同济医院呼吸内科)摘要:目的探讨支气管哮喘患者外周血单个核细胞(PBMCa)pa8MAPK 表达的变化及地塞米松(DEX)对其的影响.方法分离培养哮喘患者和正常健康者的 PBMCs.分别采用蛋白质印迹和ELISA 方法检测 PB
2、MCs 核蛋白 p38MAPK 的表达及细胞上清液中 IL4,IL?5 的蛋白质浓度.结果哮喘对照组PBMCs 核蛋白 p38MAPK 表达及细胞上清液中 IL-4,IL-5 的蛋白质浓度较正常对照组显着升高(P0,001),DEX 处理组核蛋白 p38MAPK表达及细胞上清液中 IL-4,IL-5 的蛋白质浓度较哮喘对照组显着降低 (P0.01).通过直线相关分析发现,PlB.MCs 核蛋白 p38MAPK 表达与培养上清液中 IL-4,IL?5 蛋白质含量之间均呈显着正相关(r 分别 =0.71,0.54.P均0,01).结论 p38MAPK 可能参与支气管哮喘的病理生理过程.DEX 可能
3、通过作用于 p38MAPK 这一靶点发挥其抗炎效应.关键词:支气管哮喘;外周血单个核细胞;p38 蛋白激酶; 地塞米松中图分类号:R562,25 文献标识码:A 文章编号:10080635(2005)02008903EffectofDexamethasoneonp38Mitogen?activatedProteinKinaseinPeripheralBloodMononuclearCellsinPatientswithBronchialAsthmaHUANGCuiping,ZHAOXinyuan,ZHANGZhen-xiang,etal(DepartmentofInternalMedicine
4、,thefirstAffiliatedHospitalofXianningCollege,XianningHubei437100,China)ABSTRACT:ObjectiveTostudythechangesofp38mitogenactivatedproteinkinase(p38MAPK)inperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)inpatientswithbronchialasthmaandtheeffectsofdexamethasone(DEX)onit.MethodsPBMCswerecollectedfromasthmaticpatien
5、tsandnormalsubjects.UsingWesternblotandELISA.theexpressionofphosphop38MAPKinPBMCsandtheconcentrationofIL-4,IL-5insupematantswererespectivelymeasured.ResultsTheexpressionofphosphop38MAPKinPBMCsandtheconcentrationofIL-4.IL.5insupematantswerehigherinasthmaticgroupthanthoseinnormalgroup(P0.O1).ByDEXtrea
6、ted.theaboveindexesweredecreasedsignificantlycomparedwiththoseinasthmaticgroup(P0.01).Therewerepositivecorrelationsbetweentheexpressionofphosphop38MAPKandtheconcentrationofIL4,IL-5insupematants(r=0.71,0.64,P0.01).Conclusionp38MAPKmayplayaroleinpathophysiologicalprocessofasthma.DEXcouldeffectivelytre
7、atasthmabyinhibitingtheexpressionofp38MAPK.?湖北省教育厅资助项目 (200311004)90 咸宁学院(医学版)20o5 年第 19 卷第 2JournalofXianningCoilege(MedicalSciences)KEYWORDS:Bronchialasthma;Peripheralbloodmononuclearcells;p38mitogenactivatedproteinki.nase;Dexamethasone支气管哮喘(简称哮喘) 是一种严重威胁人类健康的慢性非特异性气道炎症,以肥大细胞,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎症细胞及其产
8、生的多种细胞因子(IL4,IL 一 5 等)和炎症介质参与了哮喘的发病过程.丝裂原活化蛋白激酶超家族(mi.togenactivatedproteinkinase,MAPKs)是一种在进化上非常保守的信号分子,能转导细胞外信息到细胞核内,活化转录因子,调控相关基因的表达,被认为是多条信号途径的交汇点和共同通道.它包括细胞外调节激酶(ERK)通路,c-jun 氨基末端激酶(JNK)通路,p38 通路和 ERK5 通路.我们既往的研究表明 p38MAPK 在转录和翻译水平调控哮喘大鼠外周血单个核细胞 Th2 细胞因子 IL4,IL-5 的表达,哮喘常规治疗药物地塞米松 (DEX)抑制哮喘大鼠肺组织
9、 p38MAPK 的表达.但DEX 对哮喘患者外周血单个核细胞 p38MAPK 表达的影响目前尚未见报道.本文对此作一探讨.1 对象和方法1.1 对象哮喘组:选择本院门诊和住院哮喘患者 3O 例,男 16 例,女 14 例,年龄 1558 岁,平均年龄 31岁.全部病例均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组 2003 年制定的支气管哮喘防治指南的诊断标准;正常对照组:2O 例,均为无吸烟史,无过敏性疾病史的健康者,其中男,女各 1O 例,年龄 1956 岁,平均年龄 28 岁.两组人群中性别,年龄差异无显着性(P0.05).所有受试者无严重心,肝,肾疾患及恶性肿瘤病史,近 4 周内未使用糖皮质激
10、素等免疫抑制剂或细胞毒药物,抽血前 12h 内未使用任何药物.1.2 方法1.2.1PBMCs 分离和培养无菌条件下.取乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)抗凝空腹静脉血 5ml,以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞.离心洗涤后,用 RPMI?1640 培养基调细胞浓度为 110/L,接种于 24 孔培养板内,分正常对照组,哮喘对照组和 DEX 处理组(加人终浓度为 1moL/L 的 DEX).置于 5%CO2,37C 培养箱内培养 8 小时,收集细胞和细胞上清液备用.1.2.2 细胞核蛋白 p38MAPK 含量的检测细胞核蛋白的提取参考文献进行】.收集培养的 PBMCs110 个,4,加人低渗缓冲
11、液(10mMHEPES,pH7.9,10mMKCI.0.1mMED.TA,0.1mMEGTA,1mMD,I1,0.5raMPMSF)破坏细胞膜,2700g,离心 2min.然后加人高渗缓冲液(20mMHEPES,pH7.9,0.4MNaCI.1mMED.TA,1mMEGTA,1mMD,I1,1mMPMSF)破坏核膜,20000g,离心 3min,取含核蛋白的上清液一7O保存.经蛋白定量,按每条泳道加核蛋白2504g 进行十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)分离蛋白质,经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上.加人稀释度为 1:400 的兔抗p38 多克隆抗体(美国 SantaC
12、ruz 公司),4孵育2O 小时.封闭液孵育后,加人辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG,稀释度为 1:200,室温孵育 1 小时.经 TBS 洗涤 ,DAB 显色.用图象分析仪测定各条带的光密度值作定量分析.1.2.3IL4,IL-5 的蛋白质含量测定采用 ELISA 方法检测细胞上清液中 IL4,IL-5的蛋白浓度.试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司.操作步骤按试剂盒说明书进行.1.3 统计学处理全部数据均用 SAS 统计软件进行分析.计算各组的s,组间差异的显着性采用方差分析和 q检验,两变量之间的相关程度采用直线相关分析.P0.05 认为差异有显着性.2 结果2.1PBMCs 核蛋白 p
13、38MAPK 含量的变化蛋白质印迹发现大约在 38kD 的分子量位置上出现阳性条带.图象分析结果显示正常对照组PBMCs 核蛋白提取物有一定水平的 p38MAPK 表达.哮喘对照组 PBMCs 核蛋白 p38MAPK 表达则显着升高,与正常对照组比,P0.01.加人 DEX处理后.核蛋白 p38MAPK 表达显着降低,与哮喘对照组比较,差异具有显着性(P0.01).(表 1)2.2PBMCs 培养上清液中 IL4,IL?5 蛋白质含量的变化哮喘组 PBMCs 培养上清液中 IL4,IL-5 蛋白质含量较正常对照组显着升高(P0.01).DEX处理组 PBMCs 培养上清液中 IL-4,IL-5
14、 蛋白质含量较哮喘组显着降低(P0.O1).(表 1)堕兰塑)2oo5 年第 19 卷第 2 期J0umal.fXianningCollege(Medicalsi.)912.3PBMCs 核蛋白 p38MAPK 表达和培养上清液中 IL-4,IL-5 蛋白质含量之间的相关分析通过直线相关分析发现,PBMCs 核蛋白p38MAPK 表达与培养上清液中 IL-4,IL-5 蛋白质含量之间均呈显着正相关(r 分别:0.71,0.64.P均0.01).表 1PBMCs 核蛋白 p38MAPK 的表达及细胞培养上清液中 IL-4,IL-5 蛋白质含量的变化(s)与正常对照组比较,PO.01;与哮喘对照组
15、比较,PO.013 讨论MAPKs 作为真核细胞转导细胞外信号到细胞内的四大信号系统之一,在信号转导过程中发挥重要作用.研究证实 p38MAPK 通路主要被促炎因子,应激刺激,细菌病原体及其产物等磷酸化激活,激活后的 p38MAPK 即由胞浆进入到细胞核,活化转录因子,调节特定基因的表达 J,参与应激条件下细胞的免疫调节,炎症反应和细胞凋亡过程.因此,可以用细胞核提取物 p38MAPK 的含量来反映其活化程度.本实验结果表明哮喘对照组外周血单个核细胞核蛋白 p38MAPK 表达较正常对照组显着升高,提示 p38 蛋白激酶途径可能参与了哮喘发病的病理生理过程.目前认为哮喘的本质是一种慢性非特异性
16、气道炎症,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞是其主要的效应细胞,其中 Th2 细胞产生的 IL-|和 IL-5 在炎症过程中发挥了关键作用 J.DEX 作为当前防治哮喘最有效的抗炎药物,可通过抑制细胞因子和炎性介质的生成,抑制炎症细胞的聚集,迁移和活化,稳定细胞膜等多种途径发挥作用.随着分子生物学技术的发展,对 DEX 治疗哮喘的分子机制有了进一步的研究.Adcock 等研究发现 DEX是转录因子 NFKB 的强烈抑制剂 ,通过作用于 NFKB 而降低炎症蛋白的释放.本实验结果显示DEX 显着抑制哮喘患者外周血单个核细胞磷酸化p38MAPK 及细胞培养上清液中 IL-|,IL-5 的表达,并且 p38MA
17、PK 的表达与培养上清液中 IL-|,IL-5蛋白质含量之间均呈显着正相关,提示 DEX 可能通过作用于 p38MAPK 这一靶点发挥其抗炎效应.深入研究 p38MAPK 在哮喘发病机制中的具体调控作用,对临床支气管哮喘的防治可能有重要意义.参考文献:1RosenLBandGreenbergME.Stimulationofgrowthfactorreceptersignaltransductionbyactivationofvoltage?-semi?tivecalciumchannelsJ.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(3):11132黄翠萍,张珍祥 ,徐永健.哮喘大
18、鼠肺组织 p38 蛋白激酶表达的变化及地塞米松对其影响J.中华微生物和免疫学杂志,2003,23(5):3343中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义,诊断,治疗及教育和管理方案)J.中华结核和呼吸杂志,2003,26:1324SchreiberF,MatthiasP,MtiUerMM,eta1.Rapiddetec.tionofoctamerbindingproteinwitll“mini-extracts“.pre-paredfromasmallnumberofcellsJ.NucleicAcidsRe-seach,1989,17(15):64195OnoKa
19、ndHanJH.Thep38signaltransductionpathwayactivationandfunctionJ.CellSignal,2OOO,12(1):16SugitaM,KuribayashiK,NakagomiT,eta1.Allergicbronchialasthma:airwayinflammationandhyperrespons-ivenessJ.InternMed,2003,42(8):6367AdcockIM,ShirasakiH,GelderCM,eta1.TheeffectsofglucocorticoidsonphorbolesterandcytokinestimulatedtranscriptionfactoractivationinhumanlungJ.LifeScl,1994,55:1147(收稿日期:20050221)
