1、中国药理学通报 2003 年第 12 期槐耳清膏体外抑制血管生成的实验研究许戈良 荚卫东 马金良 余继海(安徽省立医院普外科，合肥 230001)摘要:目的 探讨槐耳清膏对血管内皮细胞体外构建新生血管的抑制作用及其机制。方法 应用 MTT 实验、流式细胞仪、Matrigel 实验，体外研究槐耳清膏对血管内皮生长因子 (VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和分化成血管能力的影响。 结果 在浓度为 0.110gL-1时，槐耳清膏明显抑制 VEGF 诱导的内皮细胞增殖，呈量效关系：流式细胞仪检测表明，槐耳清膏阻止内皮细胞由 S 期进入 G2/M 期；槐耳清膏浓度为 1gL-1 时，可
2、以抑制内皮细胞体外分化成管样结构；浓度为 10gL-1 时，则完全阻断内皮细胞体外分化成管样结构的能力。 结论 槐耳清膏对血管内皮细胞体外构建新生血管具有抑制作用，其机制可能与 S 期阻滞有关。关健词 槐耳清膏；内皮细胞；血管生成；细胞周期中国图书分类号 R273；R282.71；R322.12；R329.24 ；R329.25；R977.6文献标识码 A 文章编号 1001-1978(2003)12-1410-03槐耳清膏(extract of fungi of huaierEFH) 是药用真菌槐耳(Trameyes robiniphila Murr)的提取物，其主要的活性成分是多糖蛋白，含
3、多种氨基酸和微量元素 1.2,已广泛应用于临床肿瘤治疗 25。为进一步探讨其抗癌机制，我们研究了槐耳清膏对血管内皮细胞体外构建新生血管的影响。1 材料和方法1.1药品与试剂槐耳清膏由启东盖天力药业有限公司提供；MTT(四氮甲基四唑蓝)购自 Sigma 公司;VEGF(Pepro tech,英国)用无血清 DMEM 培养液配制成 10gL-1，置于20保存待用；Matrigel(生产因子减少型)为 Becton Dickinson 公司产品。1.2 仪器 BB5060 型 CO2 培养箱( 美国 Heraeus 公司)；Biocell htl 型全自动酶标仪(奥地利)；CK型倒置显微镜(日本 O
4、lympus 公司)；流式细胞仪( 美国 Coulter 公司) 。1.3 HUVECs培养及鉴定 无菌收集 30cm 长新鲜的新生儿脐带，参考 Jaffe 等 0的方法，常规培养 HUVECs。待细胞长成单层后，经消化、传代培养 510d 后，HUVECs 融合在一起，倒置显微镜下观察见培养的 HUVECs 呈铺路石状镶嵌单层排列。内皮细胞经流式细胞仪检测 VWF 和 CD31 因子检测证实。实验中取 35 代内皮细胞进行。1.4 MTT实验 取对数生长期 HUVECs，以 1108 L-1 细胞接种于 96 孔板， 100lwell-1,每组设 5 个平行孔。在含 10%FBS、VEGF(
5、10gL -1)的 DMEM 的培养液中培养 24h 后(5%CO 2、37C)，加入含不同浓度槐耳清膏(0 、0.01、0.1、1.0 及 10gL-1)的上述培养液 100l ，继续培养48h。加入 MTT 液，培养 4h 后，弃上清液，加入 100lwell-1 二甲基亚砜，微量振荡仪振荡 5min，按参考波长 492nm、参比波长 630nm 应用酶标仪测定各孔吸光度值 (A 值) 。按下列公式计算细胞生长抑制率(Inhibitory RateIR)：IR=( 正常对照组 A 值用药组 A 值)正常对照组 A 值100% 。中国药理学通报 2003 年第 12 期Fig1 The ef
6、fect of EFH on the inhibition of tube formation induced by VEGF(400)A：HUVECs formed a branching，anastomosing network of capillary like tubules with multicentric junctions induced by VEGF；B：A remarkable inhibition of tube formation was observed in the presence of 1gL-1 EFH；C：Complete inhibition was o
7、btained at 10 gL-1 EFH1.5流式细胞仪测量细胞周期 HUVECs 单细胞悬液接种后，改用无血清 DMEM 培养液 (含 0.1%BAS、VEGF10gL -1)培养 24h 使细胞周期同步化。加入含槐耳清膏(1.0g L-1)DMEM 培养液 5%CO2、37C 环境下培养 48h 后，收集细胞，制成单细胞悬液，体积分数为 70%的冷乙醇固定，在经Rnase 消化、碘化丙碇 (PI)染色 30min，样品经流式细胞仪测试。1.6 Matrigel实验 取 100l 融化的生长因子减少型 Matrigel 加入 24 孔板上，37C 孵育 1h 使 Matrigel 聚合成
8、胶。以 1108L-1 细胞接种在胶上， 100lwell-1，加入含不同浓度槐耳清膏 (0、1.0及 10gL-1)的无血清 DMEM 培养液(10gL -1VEGF、0.1%BSA),37C 、5%CO 2 培养箱孵育 48h 后，应用倒置显微镜，观察槐耳清膏对内皮细胞体外构建血管的影响。1.7统计学外理两样本均数比较用 t 检验，组间比较采用方差分析处理。2结果2.1槐耳清膏对 HUVECs体外增殖的抑制作用在浓度为 0.110g.L-1 时，槐耳清膏明显抑制 VEGF 诱导的 HUVECs 的增殖，随着槐耳清膏药物浓度增加，内皮细胞生长抑制率增加，并呈量效关系(Tab1)2.2槐耳清膏
9、对 HUVECs细胞周期的影响 HUVECs 经槐耳清膏(1.0g .L-1)作用 48h 时，与对照组比，S 期细胞比例明显增多，G2/M 细胞比例明显减少，而 G0/G1 期细胞增殖不受影响(Tab2) 。流式细胞仪检测显示，槐耳清膏能够阻止内皮细胞由 S 期进入 G2/M 期，产生 S 期阻滞。Tab1 Inhibitory effect of EFH on proliferation of HUVECs stimulated by VEGF(Xs,n=5)Group A IR/%Control 0.5740.067 EFH(0.01gL-1) 0.5100.043 11.3EFH(0.
10、1gL-1) 0.4290.061 . 25.7EFH(1gL-1) 0.3140.059 45.3EFH(10gL-1) 0.2260.035 60.7P0.05, P0.01 vs control group2.3槐耳清膏对 VEGF诱导的 HUVECs分化的影响HUVECs 在 2024h 内粘附于 Matrigel 表面：在 VEGF 诱导下， HUVECs 在 2428h 内分化成分枝状毛细血管样结构(Fig1A)。槐耳清膏浓度为 1gL-1 可以抑制 VEGF 诱导的HUVECs 分化成管样结构(Fig1B);浓度为 10gL-1 时，则完全阻断 HUVECs 体外分化成管样结构的
11、能力(Fig1C).3讨论肿瘤的生长和转移依赖于血管生成。肿瘤血管生成是由血管内皮细胞、肿瘤细胞与其微环境相互影响的结果，其中血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化是新生血管形成过程中的关键环节，并且受到 VEGF 的调控，直接抑制血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化，是抗血管生成最有效的靶点。槐耳清膏是药用真菌槐耳的提取物，其主要的活性成分是多糖蛋白，含多种氨基酸和微量元素，广泛应用于临床肿瘤治疗，但其确切的机制尚未完全清楚。本实验应用槐耳清膏对 VEGF 诱导的 HUVECs 的增殖和分化作用进行了体外研究。当槐耳清膏的浓度为 0.110gL-1 时，VEGF 诱导的内皮细胞增殖受到明显的抑
12、制，并呈量效关系。Matrigel 实验显示，槐耳清膏浓度为 1gL-1 可以抑制 VEGF 诱导的 HUVECs 分化成管样结构；浓度为 10gL-1 时，则完全阻断 HUVECs 体外分化成管样结构的能力。上述结果初步表明，VEGF 诱导血管生成过程中的关键环节不同程度受到槐耳清膏的抑制，提示槐耳清膏可能通过影响 VEGF 诱导血管内皮细胞的增殖和分化而具有潜在的抗血管生成作用。为进一步探讨槐耳清膏的作用机制，我们应用流式细胞仪检测了槐耳清膏对HUVECs 细胞周期的影响，结果发现槐耳清膏特异性阻止内皮细胞由 S 期进入 G2/M 期，产生 S 期阻滞。由于细胞处于被抑制状态，槐耳清膏组
13、S 期的细胞比例增高，而 G2/M 期细胞比例下降。有关槐耳清膏对内皮细胞周期的调控机制有待深入研究。本实验结果初步表明，槐耳清膏对血管内皮细胞体外构建新生血管具有抑制作用，为进一步探索槐耳清膏抗肿瘤机制提供了新的思路。鉴于离体实验存在一定的局限性，实验结果可能受药物本身的 pH 值、离子浓度和渗透压等因素的影响。因此，尚有待进一步采用血管生成体内模型证实。 （2003-07-16 收稿.2003-09-08 修回）参考文献1 郭跃伟，槐耳菌丝体多糖的研究(II)：槐耳多糖的组成及摩尔比测定中国药科大学学报1992：23(3)：15572 庄毅抗癌新药槐耳冲剂的研究中国药学杂志1998：33(
14、5)27353 薛兆祥，朱永泉沈鸣曙 et al槐耳冲剂治疗恶性肿瘤 582 例临床分析中国实用外科杂志1994：14(6)：3824 赵文生金克联合化疗对复发性非霍奇金淋巴瘤的疗效中国肿瘤1999：8(5)：23785 赵红星，张国政金克治疗老年晚期肝癌近期疗效观察中国肿瘤2001：10(5)：30566 Jaffe EA.Nachman RL.Becker CG，Minick CR.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins:identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest.1973:52(11):274556中国药理学通报 2003 年第 12 期安徽省自然科学基金安科医药专项资助课题.NO 01043708 作者简介：许戈良.男.46 岁.教授.硕士生导师。
