1、369急性淋巴细胞白血病患儿红血球中 6巯基嘌呤及其代谢产物的 HPLC 分析项目完成人：牟德海 郑家概 闫世平 辜英杰 喻凌寒项目完成单位：中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急检测技术重点实验室6巯基嘌呤（6-mercaptopuring, 6MP）和硝基咪唑硫嘌呤（ azathiopurine, Aza）主要作为抗肿瘤药用于治疗急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL） ，或者作为免疫抑制剂用于治疗炎性肠病、风湿关节炎、系统性红斑狼疮和抑制器官移植病人的急性排斥。Aza 是 6MP 的 1甲基4硝基5 咪唑硫衍生物，在体内降解生产 6MP，
2、Aza 抗肿瘤和免疫抑制的药物活性主要是来自其降解产物 6MP 的代谢产物。 NNNHNSHHO OH6-thiouric aidNNNHNSHNNNHNSCH36-mercaptourine6-methylmercaptourineNNNNOOHCH2H2PO4 NNNNH2NOOHOHCH2H3P2O7 NNNNH2NOOHOHCH2H4O10P3NNNNH2NOOHCH2H3P2O7 NNNNH2NOOHCH2H4P3O106-thioguanosine5-diphsphat6-thioinsine5-mnphphat 6-thioguanosine5-tripsphat6-thiode
3、oxyguanosine5-iphsphte 6-thiodeoxyguanosine5-triphsphteSH SH SHSH SHRNADNAXOTPMTHGPRT DPKR DPKOH6-TGsNNNHNSNNNO2H3Cazthiopurine图 1. 6巯基嘌呤的代谢 13706MP 在体内的代谢主要有三条途径：（1）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的作用下转化为 6硫次黄嘌呤核苷一磷酸（6-thioinosine monophosphate， TIMP） ，TIMP 随后在
4、一系列酶促反应中转化为活性代谢物 6硫鸟嘌呤核苷（6thioguanine nucleotides, 6TGNs）发挥细胞毒作用；（2）在硫嘌呤甲基转移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）作用下转化为无药物活性的甲基硫嘌呤（6methylmercaptopurine, 6MMP）;（3）在黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）作用下转化为 6硫尿酸（6thiouric acid, 6TUA ） 1，见图 1。与 6MP 转化为活性代谢产物性 6TGNs 相竞争的有两条途径：在 TPMT 作用下转化为 6MMP 和在 XO 作用下转化为 6TU
5、A。XO 活性在个体之间的差异不大，而TPMP 活性在不同个体之间有很大的差异。因而病人对 6MP 反应（即药物的疗效和毒性）的差异主要决定于其体内 TPMT 的活性。已经发现红细胞中 6TGNs 的含量与TPMT 的活性呈负相关关系。在标准用药剂量下，TPMT 活性低的个体能积累高浓度的6TGNs 导致致死性的骨髓细胞毒性。相反 TPMT 活性高的个体对硫嘌呤类药物可能没有反应，因为它们很快就被转化为无活性的 6MMP。因而通过监测接受硫嘌呤类药物治疗的病人血红细胞内 6MMP 和 6TGNs 的水平，据此确定准确的用药剂量，对提高治疗效果、减小药物毒副作用是非常关键的。在本项目的资助下，我
6、们与广州医学院第一附属医院合作，研究建立了急性淋巴细胞白血病患者红血球中 6MP 及其代谢产物的高效液相色谱分析方法，为 6MP 个性化治疗提供基础。1 实验1.1 仪器与试剂6巯基嘌呤（6mercaptopurine, 6MP ） 、6硫鸟嘌呤（6thioguanine, 6TG） 、6硫黄嘌呤（6thioxanthine, 6TX） 、6甲基硫嘌呤（6methyl mercaptopurine, 6MMP） 、戊醇、乙酸苯汞（phenyl mercury acetate, PMA）和二硫苏糖醇（DL dithiothreitol, DTT）为 Sigma 公司产品；甲醇、甲苯为色谱纯，其他
7、试剂均为分析纯。高效液相色谱仪：岛津 LC6A，配 LC6A 高压输液泵、柱温箱、SPD-6AV 可变波长紫外可见分光检测器、系统控制器、CR3A 积分仪和色谱工作站。1.2 试剂配制（1）PMA 戊醇甲苯溶液的配制：取 1.85 mL 戊醇，加入 1000 mL 甲苯中，摇371匀，再加入 0.5 g PMA，轻轻搅动 1 h 使 PMA 溶解，置于暗处保存。此溶液含 PMA 1.3 mmol/L，含戊醇 170 mmol/L。（2）3.75 mmol/L DTT 水溶液配制：取 289.2 mg DTT 溶于 500 mL 水中。（3）0.5 mol/L H 2SO4。（4）3.4 mol
8、/L NaOH。（5）0.1 mol/L HCl。1.3 标准溶液配制分别取 16.8 mg 6TG、 16.6 mg 6MMP 、17.0 mg 6TX 和 17.1 mg 6MP 溶于水中并定容于 100 mL，此溶液为贮备液 I，含每种硫嘌呤 1.00 mol/mL。取 10 mL 贮备液 I，稀释至 100 mL，为贮备液 II，含每种硫嘌呤 100 nmol/mL；用贮备液 II 稀释成 1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL 和 20 nmol/mL 的系列标准溶液备用。1.4 样品处理（1）血红细胞制备：采集正在接受
9、硫嘌呤治疗的病人全血样本，肝素锂抗凝，室温下 1000g 离心 10 min，弃去血浆和白血胞，红细胞以 2 倍体积的生理盐水洗涤两次，最后红细胞重新悬浮于生理盐水中，使红细胞的浓度约为 8108细胞/200L。取少量作红细胞的准确计数，其余在20下保存至分析。（2）样品提取：200 L 血红细胞（约含 8108红细胞）加入有 800 L 3.75 mmol/L DTT 的 10 mL 螺旋口试管中，再加入 500 L 0.5 mol/L 的 H2SO4，盖紧，置于100烘箱中水解 1 h。在这一步中，硫嘌呤核苷水解转化为相应母体硫嘌呤和甲基硫嘌呤，如 6TGNs 水解生成 6TG、6TIMP
10、 水解生成 6MP 、6甲基巯基嘌呤核苷转化为 6MMP，硫嘌呤和甲基硫嘌呤可以和乙酸苯汞形成复合物而被有机溶剂萃取出来。水解物冷却后，向水解管中加入 500 L 3.4 mol/L 的 NaOH 后立即加入 6 mL PMA戊醇甲苯溶液，振荡 10 min，离心。吸取 5 mL 甲苯相于具塞离心试管中，加入 200 L 0.1 mol/L HCl，在旋转混合器上混合 320 s，离心，弃去上层甲苯相，取水相 50 L 注入色谱仪进行于 HPLC 分析。1.5 色谱条件色谱柱：C18 反相柱。流动相 A：0.2%的乙酸水溶液；流动相 B：甲醇。372梯度洗脱程序：其中 016 min 为分析梯
11、度，四种物质在 16min 内全部出峰，1615 min 为洗色谱柱的时间。时间（min） A 浓度（） B 浓度（）0 100 016 20 8016 0 10025 0 10025 100 0检测波长：012.5 min 波长为 340 nm，检测 6TG、6MP 和 6TX；12.5 min后切换到 290 nm，检测 6MMP 。柱温：40。流速：1.0 mL/min。进样体积：10 L。2 结果2.1 色谱图在上述色谱条件下， 6TG、6MP、 6TX 和 6MMP 混合标准溶液的色谱图见图 2，四种物质出峰的时间依次为 9.26、9.96、10.84 和 15.57 min。从图
12、2 可以看出，色谱分离状况良好，峰形对称，四种物质均达到基线分离，分离度1.5。图 2. 梯度洗脱分析 6MP 及其代谢产物的高效液相色谱图色谱柱：C18；流动相流 A：0.2%的醋酸，流动相 B：甲醇；梯度：0 min 时，100%A， 16 min 时， 20%A80%B，检测器：012.5 min 为 340 nm， 检测 6TG、6MP、 6TX，12.5 min 以后切换为 290 nm，检测 6MMP ；柱温： 40；流速：1.0 mL/min。进373样量：每种物质 100 pmol/10 L。保留时间：6TG，9.26 min；6MP 9.96 min，6TX 10.85 mi
13、n；6MMP，15.57 min。2.2 标准曲线将 1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL 和 20 nmol/mL的系列混合标准溶液进样 10 L，得到每种物质的峰面积，峰面积对进样量进行线性拟合，拟合结果见表 1 和图 3。本方法对红血球中 10 pmol/8108 RBC 含量水平的6TG 、6MP、 6TX 和 6MMP 可进行准确地检出和定量分析，满足临床应用的要求。表 1. 6TG 、6MP 、6TX 和 6MMP 的标准曲线及线性拟合参数峰面积进样量pmol 6TG 6MP 6TX 6MMP10 1023 880
14、2669 96120 1825 1732 5838 198650 4423 4032 11095 4639100 9051 8256 23232 9435150 14092 12985 33793 13621200 18907 16629 43016 19012Y=aX+b y=94.5x-130.2 y=84.1x-9.4 y=213.5x+1077.7 y=93.6x+9.3R2 0.9993 0.9989 0.9980 0.99893746 TXy = 213.54x + 107.7R2 = 0.9801002003004005000 50 10 150 20进 样 量 ， pmol峰面
15、积6 MPy = 93.581x + 9.3091R2 = 0.989050010015002000 50 10 150 20进 样 量 ， pmol峰面积6 TGy = 94.532x - 130.16R2 = 0.993050010015002000 50 10 150 20进 样 量 ， pmol峰面积6 MPy = 84.095x - 9.3765R2 = 0.989020040060080010012001400160018000 50 10 150 20进 样 量 ， pmol峰面积图 3. 6TG、6MP 、6TX 和 6MMP 的标准曲线2.3 精密度和准确度向未接受硫嘌呤治疗
16、的健康人红血球中加入低、中和高三个浓度的混合标准溶液，然后按照 1.4 的方法进行处理，按 1.5 的方法进行色谱分析，平行 5 份样品，计算每个标准加入水平下的回收率及其变异系数，结果见表 2。表 2. 6TG、6MP 、6TX 和 6MMP 分析的精密度和准确度加入量 批内（n=5) 批间（n=5)(pmol) 测得量 回收率 RSD 测得量 回收率 RSD(pmol) (%) (%) (pmol) (%) (%)平均值SD 平均值SD 6-TG 20 19.2 0.9 96.0 4.7 19.1 1.5 95.5 7.9 50 48.1 2.1 96.2 4.4 47.3 4.7 94.
17、6 9.9 200 188.1 4.6 94.1 2.4 194.4 11.3 97.2 5.8 6-MP 20 19.7 0.9 98.5 4.6 19.2 1.4 96.0 7.3 50 49.3 2.2 98.6 4.5 47.9 4.1 95.8 8.6 200 194.5 5.6 97.3 2.9 194.4 12.3 97.2 6.3 6-TX 20 19.4 0.7 97.0 3.6 19.0 1.4 95.0 7.4 37550 48.9 2.3 97.8 4.7 48.5 4.5 97.0 9.3 200 195.3 7.3 97.7 3.7 190.4 12.3 95.2
18、6.5 6-MMP 20 19.2 0.8 96.0 4.2 19.1 1.5 95.5 7.9 50 49.4 2.0 98.8 4.0 47.3 4.7 94.6 9.9 200 196.3 7.6 98.2 3.9 194.4 10.4 97.2 5.3 2.4 样品分析结果在建立上述能同时分析 6TG、6MP、6TX 和 6MMP 等 4 种物质的 HPLC方法之前，我们首先建立了前 3 种物质 6TG、6MP 和 6TX 的 HPLC 方法。本方法采用等度洗脱，具体如下：色谱柱：C18；流动相为 10：90 的甲醇水，含100mmol/L 三乙胺并用磷酸调 pH 值为 3.2，脱气前
19、加入 0.5 mmol/L 的 DTT；流速：1.0 ml/min；检测波长：335 nm。色谱图见图 4。从图 4 可以看出，6TG、6MP 和 6TX 在等度洗脱的条件下，在 8 min 内得到了很好的分离。方法的线性、精密度和准确度均满足要求。但用这个方法，在我们的实验条件下，6MMP 不易出峰。我们用等度洗脱方法，分析了正在接受硫嘌呤药物治疗的 ALL 患者的 49 份血样，典型的色谱图见图 4B。以正常健康人的血样为空白对照，其色谱图见图 4C，分析结果见表 3。A376图 4. 等度洗脱分析 6TG 、6MP 和 6TX 的高效液相色谱图A混合标准，B正在接受硫嘌呤药物治疗的 AL
20、L 患者血样，C正常健康人的血样。色谱柱：C18；流动相为 10：90 的甲醇水，含 100mmol/L 三乙胺并用磷酸调 pH 值为 3.2，脱气前加入 0.5 mmol/L 的 DTT；流速：1.0 ml/min；检测波长：335 nm。保留时间：6-TG，4.72 min；6-MP ，5.46 min；6-TX，7.17 min。表 3. 接受硫嘌呤药物治疗的 ALL 患者红血球中 6TG、6MP 和 6TX 的等度洗脱高效液相色谱分析结果（单位：pmol/810 8 RBC）No 6-TG 6-MP 6-TX No 6-TG 6-MP 6-TX1 0 10 10 27 10 10 10
21、2 0 10 10 28 9 10 103 0 10 10 29 19 310 104 21 10 10 30 110 10 105 27 10 10 31 10 36 106 0 10 10 32 10 10 107 35 12 10 33 10 10 108 0 10 10 34 5 10 109 23 10 10 35 10 10 1010 15 10 10 36 10 10 1011 50 15 10 37 10 10 1012 0 17 10 38 13 8 13 10 39 10 10 10BC377No 6-TG 6-MP 6-TX No 6-TG 6-MP 6-TX14 0 1
22、0 10 40 10 10 1015 8 14 10 41 10 10 1016 0 10 10 42 10 10 1017 18 8 10 43 14 10 1018 54 35 10 44 10 10 1019 45 10 10 1020 46 10 10 1021 14 10 10 47 10 10 1022 13 10 10 48 16 10 1023 21 10 10 49 14 10 1024 0 10 10 50 10 10 1025 5 4 10 51 10 10 1026 65 10 10在本项目的研究中，我们先建立了等度洗脱高效液相色谱法，并用此方法分析了一批临床样品。由于
23、等度洗脱法 6MMP 不能很好出峰，我们继续对方法进行改进，采用梯度洗脱程序，在优化的实验条件下，在 16 min 内 6TG 、6MP 、6TX 和6MMP 得到良好的分离，并用向正常健康人血样中加标的方法进行了精密度和准确度实验，结果良好。由于 ALL 患者血样不易得到，所以还没有用梯度洗脱 HPLC 法分析ALL 患者红血球中 6MP 及其代谢物的结果。3 讨论由于硫嘌呤类药物治疗 ALL 等疾病的效果和毒副作用在患者个体之间的差异很大，所以，在治疗的过程中监测病人体内硫嘌呤类药物的活性代谢学产物（如 6TGNs）和非活性代谢产物（如 6MMP） ，并以次为依据调整治疗和用药方案，进行个
24、体化治疗，对提高药物疗效、减小毒副作用具有非常主要的意义。Lennard 和 Singleton2, 3建立了同时测定红细胞中 6TGNs 和 6MMPNs 的 HPLC方法，其样品处理方法是将红细胞样品在 1.0 mol/L 的 H2SO4介质中于 100 下水解 1 h，使 6TGNs 和 6MMPNs 水解为相应的母体硫嘌呤 6TG 和 6MMP ，然后在碱性介质中用含乙酸苯汞的甲苯溶液将 6TG 和 6MMP 萃取到有机相甲苯中，再用 0.1 378mol/L 的 HCl 将 6TG 和 6MMP 反萃到水相中，用于高效液相色谱分析。在样品水解的过程中加入 DTT 以防止含硫基团被氧化
25、。 PMA 萃取的效率与萃取时的 pH 值密切相关，碱性越强，萃取效率越高 10。Dervieux 和 Boulieu4, 5的样品处理方法是在红血球中加入固体 DTT，然后用 HClO4沉淀蛋白，离心，提取液于 100 下水解 45 min，将硫嘌呤核苷水解转化为相应的硫嘌呤，水解液直接用于 HPLC 分析。Dervieux 和 Boulieu 的研究结果表明，6MMPNs 在酸水解的过程中会转化为 4氨基5（甲硫基）羰基咪唑衍生物，转化效率与水解时的 pH 密切相关，在硫嘌呤核苷水解转化为硫嘌呤的条件下， 6MMPNs 的转化率为100。因而在色谱分析时色谱图上没有 6MMP 的色谱峰，而
26、有 6MMP 衍生物的色谱峰。他们认为本方法不能直接测定 6MMP，但可以通过其衍生物间接测定。但Hawatari 等 6, 7稍作修饰的 Dervieux 和 Boulieu 方法却在色谱图中得到了 6MMP 的色谱峰，他们认为水解时 6MMP 并不能完全转化，因而可以直接测定红细胞中6MMP 的含量。Su 等 11用 100 L 血浆，相向中加入 25 L 1 mol/L 的 HCl，旋转混合，置上冷却，在加入 25 L TE 缓冲液，旋转混合，置冰上冷却后离心超滤除去蛋白质，取 50 L 注入液相色谱仪分析。分析时用 C18 反相柱，梯度洗脱，在 40 分钟内 6MP 及其 7 种代谢产
27、物得到良好分离。这 7 种代谢物是 6TG、6TX、6巯基嘌呤核苷（6mercaptopurine riboside, rMP） 、6硫鸟嘌呤核苷（6thioguanosine, rTG） 、6硫黄嘌呤核苷（6thioxanthine riboside, rTX） 、6MMP 和 6甲基巯基嘌呤核苷（6methylmercaptopurine riboside, rMMP） 。这种处理方法由于不用水解，可以同时测定硫嘌呤和硫嘌呤核苷。Shipkova 等 8, 9对比研究了 Lennard 和 Singleton 方法与 Dervieux 和 Boulieu 方法。结果表明，用 Dervieu
28、x 和 Boulieu 的方法测得的 TGNs 的含量是用 Lennard 和 Singleton的方法测得的含量的 2.6 倍，虽然两种方法所得到的结果是显著相关的。如果将Lennard 和 Singleton 方法中水解介质有 H2SO4改为 HClO4，则两种方法的差异减小到1.4 倍。Stefan 等也报道了近似的结果 9。文献报道的 6MP 及其代谢产物的分析结果相差很大，各实验室之间的结果可比性很差，数据也无法交流和共享，这主要与样品处理和提取方法有关。因此，分析方法的标准化是今后研究工作的重点 10。379参考文献1 Cuffari C, Seidman EG, Latour S
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31、etabolites in a single sample. J Chromatogr 1992; 583: 8390.4 Boulieu R, Dervieux T. High-performance liquid chromatographic determination of methyl 6-mercaptopurine nucleotides (Me6-MPN) in red blood cells: analysis of Me6-MPN per se or Me6-MPN derivative? J Chromatogr, B. 1999, 730: 2734.5 Dervieu
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