反义寡核苷酸中残余硫化剂的测定.doc

1、6反义寡核苷酸中残余硫化剂的测定项目完成人：郑永红 魏开华 刘炳玉 宋占军 张 松项目完成单位：国家生物医学分析中心反 义 寡 核 苷 酸 即 反 义 核 酸 （ antisense oligonucleotide） ， 其 核苷 酸 序 列 可 与 靶 RNA 或 靶 DNA 互 补 ， 抑 制 或 封 闭 基 因 的 转 录 和 表 达 ， 或 诱 导RnaseH 识 别 并 切 割 mRNA， 使 其 丧 失 功 能 。 反 义 核 酸 药 物 是 药 理 学 的 新 领 域或 新 革 命 1 ， 是 目 前 所 知 最 精 确 、 高 效 及 最 具 广 泛 意 义 的 调 控 特 异

2、 基 因 表 达的 潜 在 策 略 ， 它 既 可 以 作 为 研 究 工 具 ， 用 于 对 一 些 特 定 蛋 白 和 基 因 的 生 理 功 能的 研 究 ， 也 可 作 为 治 疗 药 物 用 于 癌 症 、 感 染 性 疾 病 等 许 多 疾 病 的 治 疗 。 然 而 反义 寡 核 苷 酸 的 功 能 在 很 大 程 度 上 取 决 于 其 稳 定 性 、 生 物 利 用 度 及 与 靶 基 因 结 合特 性 ， 通 过 特 定 的 化 学 修 饰 可 以 改 变 这 些 物 理 化 学 特 性 ， 从 而 增 加 抗 病 毒 、 抗肿 瘤 和 其 他 特 定 基 因 的 表 达

3、抑 制 活 性 。 以 硫 代 磷 酸 酯 为 骨 架 修 饰 的 硫 代 寡 核 苷酸 （ 磷 酸 二 酯 骨 架 中 的 非 桥 氧 原 子 被 硫 取 代 ） 是 最 广 泛 研 究 的 反 义 核 酸 ， 现 在进 入 临 床 的 所 有 ODN 几 乎 都 是 PS-ODN 2 ， 它 具 有 抗 核 酸 酶 水 解 、 良 好 的亲 核 性 、 方 便 的 同 位 素 标 记 等 特 点 。常 见 的 硫 代 修 饰 剂 有 Beaucage 试 剂 （ 3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxide,简 称 B） 和 二 硫 化 四 乙 基 秋 兰 姆

4、 （ Tetraethylthiuram disulfide,简 称 T） 等 ， 结 构 式 见 图 1。 然 而 反 义 核 酸 中 残 余 的 硫 化 剂 对 反义 药 物 本 身 有 副 作 用 ， 对 生 物 体 也 有 一 定 毒 性 。 因 此 ， 在 反 义 寡 核 苷 酸 药 物 的质 量 控 制 中 需 要 确 定 它 们 的 残 余 量 。1 实 验 部 分图 1 硫化剂 B 和 T 的结构式B T71 1 仪 器 与 试 剂HP 5890 气 相 色 谱 仪 ， 配 FID 检 测 器 ， HP 3394 自 动 积 分 仪 ， HP 5971 高 性 能 台 式 气

5、相 色 谱 -质 谱 联 用 仪 ， 配 有 WILLY138 谱 库 ， ZabSpec高 分 辨 磁 质 谱 仪 ， PE 235 高 效 液 相 色 谱 仪 。标 准 品 B 和 T 购 自 Sigma 公 司 (纯 度 均 大 于 99%),巯 基 乙 醇 为 Fluka公 司 ， 其 它 试 剂 均 为 色 谱 纯 。1 2 分 析 条 件气 相 色 谱 条 件 ： HP-1 非 极 性 柱 （ 30m 0.52mm 0.32 m） ； 柱 温 采用 程 序 升 温 ： 初 温 150 ， 保 持 3 分 钟 ， 以 10 /分 钟 升 温 至 250 ， 保持 10 分 钟 ； 进

6、 样 器 温 度 250 ； 检 测 器 温 度 270； 载 气 为 高 纯 氮 ， 流 速1.2mL/min； 分 流 比 15： 1； 分 流 进 样 ， 进 样 量 体 积 为 1.0 L。气 相 色 谱 -质 谱 条 件 ： HP-5TA 柱 （ 30m 0.25mm 0.25 m） ； 柱 温 采用 程 序 升 温 ： 初 温 80 ， 以 15 /分 钟 升 温 至 250 ， 保 持 10 分 钟 ； 进样 器 温 度 250 ； 检 测 器 温 度 280 ； 载 气 为 高 纯 氦 （ 纯 度 99.999%） ，流 速 32cm/min； 柱 头 压 11.5psi;分

7、流 进 样 ， 进 样 量 1.0 L。 电 离 方 式 为电 子 轰 击 （ EI） ， 接 口 温 度 170 ， 传 输 线 温 度 250 ， 电 子 能 量 70eV, 电 子 倍 增 器 电 压 1.3eV， 溶 剂 延 迟 3 分 钟 。高 效 液 相 色 谱 条 件 ： 反 相 C18 色 谱 柱 （ 250mm 4.6mm, BIO-RAD 公司 ） , 流 动 相 为 V（ 甲 醇 ） V（ 水 ） =70 30 的 溶 液 ， 流 速 1.0mL/min;检 测 波 长 220nm;柱 温 45 ， 进 样 量 50 L。1 3 标 准 溶 液 的 配 制精 密 称 取

8、11.0mg 的 B 置 于 10mL 容 量 瓶 中 ， 用 苯 定 容 ， 配 制 成1.10mg/mL 的 标 准 储 备 液 ， 逐 级 稀 释 至 所 需 要 的 浓 度 。 同 样 ， 将 T 配 制成 1.17mg/mL 的 标 准 储 备 液 。1 4 化 学 衍 生 化取 0.5mL 的 标 准 储 备 液 ， 加 入 0.5 M 的 NH4HCO3 缓冲液 0.5mL， 再 加入 浓 度 为 1.114g/mL 的 巯 基 乙 醇 10 L，在 55水浴中反应。每隔一小时采样150 L，立刻冷却至-20 保存，总共采样 6 次。将得到的样品经反相 HPLC 和磁质谱检测。结

9、果表明反应 4h 时，衍生化进行完全，并且试药与巯基乙醇的质量分数比为82：1 时，衍生化效果最佳 。2 结果与讨论21 气相色谱条件的优化2.1.1 溶剂的选择分别用二硫化碳、三氯化碳、丙酮、二氯化碳、四氢呋喃、乙腈和苯作溶剂，样品在上述溶剂中都有良好的溶解性，但除乙腈和苯之外，在气相色谱图上都有溶剂脱尾现象和溶剂对进样针的浸润作用，故考察选用乙腈和苯作溶剂。又从峰形和测定重复性方面考察，苯比乙腈的使用效果好，因此，实验中选用苯作溶剂。2.1.2 色谱柱的选择选用极性柱 HP- INNOWax、中极性柱 BP-225 和非极性柱 HP-1 三种气相色谱柱进行实验，均可进行检测。但使用前二种色

10、谱柱，色谱峰拖尾比较严重，因此会影响分析方法的精密度和线形范围。使用后一种色谱柱 HP-1 能够克服这一不足。2.1.3 柱温的选择考察了恒温和程序升温二种情况，在分离度和最低检测限量方面，程序升温好于恒温，并经反复实验比较不同升温方式，确立最佳升温程序。同时，在选择初始柱温时，既要考虑能缩短分析周期，又要考虑被检测物的灵敏度。当该温度在 100 150时，单位进样量的峰高基本不变，但当该值大于 150时，色谱峰明显拓宽，峰高度显著降低。因此，初始柱温选择 150比较合适。22 气 相 色 谱 -质 谱 的 测 定将 B 和 T 的衍生化样品分别进行 GC/MS 全扫描分析，质谱图见图 2 和

11、图 3。由图2、图 3 可知，B 和 T 的基峰分别为 168 和 116。分别以 m/z 168, m/z 116 的离子作为特征目标监测离子，同时以保留时间及 WILEY138 谱库的检索结果对样品做进一步确证，确保结果准确可靠。23 检出限与线性范围B 和 T 标准品的色谱图见图 4 和图 5。为了确定它们的最低检测限量和线性范围，对不同浓度的标准溶液进行分析，得到了不同进样量的色谱峰面积及峰高。以色谱峰高度是基线噪声高度的 2 倍作为标准计算最低检测限量，则 B 的最低检测限量为50 g/mL, T 的最低检测限量为 100 g/mL。9两 种 硫 化 剂 的 线 性 回 归 方 程

12、如 下 ：B： Y=14228X-248846,r=0.995;T: Y=13158X-343695,r=0.998其 中 X 为 进 样 量 ， Y 为 色 谱 峰 面 积 ， 线 性 范 围 ：150 g/mL 1100 g/mL。3 结 语反义寡核苷酸是一类新型药物，有关研究历史不长，特别是还未建立系统的药物质量控制标准与检验方法标准。测定反义寡核苷酸中残余硫化剂，由于课题工作量大，多步骤展开研究，因此，研究时间紧张。本课题研究了二类最常用硫化剂，尚有其它硫化剂未涉及，还有待继续研究。10参 考 文 献 1 Sommer W,Heillig M.Antisense oligonucleo

13、tides are clinically tested.Lakartidnin Gen,1999,96(4):348354. 2 Weiss B,Davidkava G,Zhou LW,et al.Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes.Cell Mol Life Sci,1999,55(3):334358. 3 Antisense 98:Work progress.Nature Biotech,1998,16(13):13191321. 4 Kamlesh J,Padiya and

14、 Manikrao M.Liquid phase oligonucleotide synthesis by alkyl H-phophonate approach.Bio Med Chem,2000,8:337342. 5 Branch AD.A good antisense molecule is hard to find.Trends Biochem Sci, 1998,23:4550. 6 Zon,G.and Stec,W.J.Phosphorothioate oligonucleotides-In oligonucleotides and their analogues:A pract

15、ical approach.Eckstein,F.Ed,IRL press:Oxford, 1991,87108. 7 Huynh Vu and Bernard L.hirschbein.Internucleotide phosphite sulfurization with tetraethylthiuram disulfide.Tetrahedron Lett,1991,32:30053008. 8 Moring,S.E.,and Colburn,J.C,etal.Analytical aspects of an automated capillary electrophoresis sy

16、stem.LCGC,1990,8:34 9 Krisztina Pongracz and Sergei Gryaznov.Oligonucleotide N3 P5thiophosphoramidates:synthesis and properties.Tetrahedon Lett, 1999(40):76617664. 10 Serge L.Beaucage.3H-1,2-Benzodithiole-3-one 1,1-dioxide as an improved sulfurizing reagent in the solid-phase synthesis of oligodeoxy

17、ribonucleoside phosphorothioates.J Am Chem Soc,1990,112:12531254. 11 Cole DL,Ravikuma V.Synthesis of phosphorothioate oligonucleotides.PT:US5663321;02.09.97. 12 M.Vaman Rao,Colin B.Reese and Zhao zhengyun.Dibenzoyl tetrasulphide-A rapid sulfur transfer agent in the synthesis of phosphorothioate anal

18、ogues of oligonucleotides.Tetrahedron Lett,1992,33:48394842. 13 P.C.J.Kamor. An efficient approach toward the synthesis of phosphorothioate diesters via the schonberg reaction.Tetrahedron Lett,1989,30:67576760. 14 M.Uaman.Solid phase synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using 10benzyltriethylammonium tetrathiomolybdate as a rapid sulfur transfer reagent.Tetrahedron Lett,1994,35:67416744.