1、弹性蛋白酶特异性抑制因子 elafin 基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达6弹性蛋白酶特异性抑制因子 elafin 基因重组腺病毒载体的构建,鉴定与表达杜先智周向东(重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆 400010)中国图书分类号 R562 文献标识码 A 文章编号 1000.484X(2007)06-0495-05摘要目的:构建 elafin 基因高效表达重组腺病毒载体 Adelafin.方法:抽提人肺总 RNA 进行逆转录多聚酶链反应(RT-PR)扩增 elafin 基因,PCR 产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒 pAdTrackCMV 上;在 BJ5183 细菌内与 pAdEasy 一
2、 1 同源重组,筛选阳性克隆,酶切,PCR 及测序鉴定;PaeI 酶切线性化后脂质体法转染 293 细胞进行包装,获得腺病毒载体 Adelafin;继之在 293 细胞内扩增,利用报告基因 GFP 监测病毒滴度和感染效率,Westernblot 检测 elafin 蛋白的表达,ELISA 鉴定 elafin 蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用.结果:酶切,PCR, 蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子 elafin 基因重组腺病毒载体 Adelafin 构建成功.结论: 成功构建了重组腺病毒载体 Adelafin,为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基
3、础.【关键词elafin 基因; 腺病毒;慢性阻塞性肺疾病Construction,identificationandexpressionoftherecombinantadenovirUScon-tainingtheelastase-specificinhibitorelafingeneDUXian-Zhi,ZHOUXiang-Dong.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospital,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400010,ChinaAbstractObj
4、ective:Toconstructthehighlyefficientexpressionrecombinantadenovirusthatexpresseselafinproteinforfurtilerstudy.Methods:TheelafingenewasamplifiedbyRTPCRfromlungtissues,thenthefragmentwasinsertedintothemultipleclonesiteofpAdTrack-CMV.ThelinearizedshuttleplasmidwashomogenouslyrecombinedwithpAdEasyIinBJ5
5、183.Thecandidateclonewl 嬲fueranalyzedbyrestrictionendonueleasedigestion,PCR,andsequencescanned.Thentherecombinedadenovirusplasmidw 硼digestedwithPacIandtransfectedinto293cellsforpackagingandamplifying.Infectiontiterandrateweremonitoredbygreenfluoresccntprotein(GFP,expression.Theexpressionofelafinprot
6、einwasdetectedbyWesternblotandELISAtoappraisethefunctionofdafinproteinforoppressingtheactivityofelasticprotease.Results:Digestionwithrestrictionendonuclease,PCR,WesternblotandELISAconfirmedthatelafingenewasclonedintotheadenovirusvectorsuccessfully.Conclusion:ThereeombinedadenovirusAdelafiniscotmtruc
7、tedsuccessfully,whichwillhebenefitforfuturestudy.Keywordselafingene;Recombinantadenovirus;Chronicobstructivepulmonarydisease(COPD)慢性阻塞性肺疾病(COPD),哮喘,肺囊性纤维化等的重要发病机制之一是支气管肺组织中蛋白酶一抗蛋白酶失衡,其中被激活的多形核白细胞(PMN)释放中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophilelastase,NE)是造成其上皮完整性损害的主要效应因子,而气道上皮产生的内源性抗损伤因子一 el 撕 n作为弹性蛋白酶特异性抑制因子在维持上皮细胞的
8、完整性中起着关键作用J.腺病毒载体具有宿主范围广,感染率高,安全性好,制备较容易等特点,已成为最重要的基因转移载体之一.我们应用本文为重庆市应用基础研究资助项目(200332)作者简介:杜先智(1964 年一),男,博士,副教授,硕士生导师,主要从事气道损伤与免疫研究,Email:;通讯作者及指导教师:周向东(1963 年一),男,博士,教授,博士生导师,主要从事气道损伤与修复研究,E.mail:DAdeasy 腺病毒系统成功构建了能表达 elafin 蛋白的腺病毒载体,为进一步研究 elafin 蛋白的生物学特性,探讨慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了基础.1 材料与方法1.1 材料1.1.1
9、 组织标本肺组织总 RNA 提取标本来自重庆医科大学第一附属医院胸外科男性肺癌患者,年龄5070 岁,因肺癌而行肺组织切除的正常肺组织.1.1.2 质粒,菌株及细胞 AdEasy 腺病毒系统由美国芝加哥大学分子肿瘤中心 TongChuanHE 教授惠赠;大肠杆菌 DHSet 及 293 细胞均为本院肝炎研究所保存.1.1.3 主要试剂及工具酶逆转录酶 MMLV 第一链合成试剂盒为上海生工生物工程公司;Pyrobest高保真 DNA 聚合酶,SalI,EcoRV,TDNA 连接酶,DNAmarker 均为 TaKaRa 公司产品;PacI,PmeI 为 NewEngland 公司产品;PCR 产
10、物纯化试剂盒为Omega 公司产品;质粒抽提试剂盒为上海搏光生物科技有限公司产品;脂质体 Lipofectamine2000 为Invitrogen 公司产品;鼠抗人 elafin 蛋白单克隆抗体为美国 USBiological 公司产品;蛋白质 marker 为上海华舜公司产品;PVDF 膜购自 LifeSciences 公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体及 DAB显色系统购自北京中山公司;测定 elafin 蛋白 ELISA试剂盒(武汉博士德生物公司);精制猪胰 NE(Sig-ma 公司); 黏蛋白多克隆抗体 17Q2(Richmond 公司).RPMI1640 为美国 G
11、ibco 公司产品,由本所配制;胎牛血清为 Hyclone 公司产品.1.1.4PCR 引物设计参考 GenBank 中 elafin 亚型基因序列NM_002638(67-420), 根据克隆所需在每条引物的 5 端引入相应的限制性内切酶识别序列及保护碱基设计引物,序列如下:P1(上游):5-CG!垒 ATGAGGGccAGCAGcI-I1cIrrGAT-3(下划线部分为 SalI 酶切位点);P2(下游):5.CG.GATATCTCAC1AACGAAACAa1,3(下划线部分为 EcoRV 酶切位点 ).引物序列由上海生工合成 .1.2 方法1.2.1 肺组织总 RNA 提取及浓度和纯度测
12、定肺组织置匀浆器,加入 Tripure 混匀后,静置 5 分钟;先后加入氯仿,异丙醇,室温下静置 510 分钟,4,12000g 离心 10 分钟;加入 75%乙醇 1ml 吹打洗涤沉淀物,4,7500g 离心 5 分钟,加入 DEPC 水40 溶解沉淀,60(2 水浴箱中孵育 1015 分钟;12%琼脂糖加电泳缓冲液 1TAE,电压 85V30 分钟.紫外分光光度计测定波长:260nm 和=280nm 的 OD 值;浓度值为:OD260 值40100;纯度由 260/280 比值表示.1.2.2 逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)将提取的肺组织总 RNA 按 MMLV 第一链合成试剂盒说明书
13、操作合成 elafin 第一条链 ;PCR 反应条件为:50l反应体系中引物终浓度 10pmol,10mmol/LdNTP4,MgCl2(25mmol/L)4l,10PCR 缓冲液 5l,TaqDNA 合成酶(5U/Ix1)0.5l,取反转录反应体系 2l 加入 PCR 反应体系中 ,轻轻混匀.94(2 变性45 秒,61退火 45 秒,72延伸 1 分钟,30 个循环,最后 72(2 总延伸 10 分钟,扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果.1.2.3PCR 产物的回收和纯化参照 DNA 分子量marker 割取含目的 DNA 片段的琼脂糖块,放入 1.5中国免疫学杂志 2007
14、 年第 23 卷ml 的离心管中;按小量胶回收试剂盒说明书回收纯化目的 DNA,紫外分光光度仪按说明测定浓度(us/m1).1.2.4 穿梭质粒 pAdTrack-CMV-elafin 的构建以SalI,EcoRV 分别酶切 pAdTrack.CMV 穿梭质粒及经纯化的 elafin 基因 PCR 产物,酶切产物经TDNA 连接酶连接后常规氯化钙法转化 DH5ot 感受态菌,铺卡那霉素抗性 LB 平板,挑取阳性克隆,接种于卡那霉素抗性 LB 液体培养基中,37(2 振摇过夜,次晨以快速法(酚/氯仿)提取质粒进行初步检测,选取可疑菌落应用小量质粒提取试剂盒提质粒,进一步对质粒进行鉴定.1.2.5
15、 穿梭质粒的鉴定双酶切鉴定:用 SalI,EcoRV 对已构建的质粒进行双酶切鉴定 ,酶切反应体系:超纯水 6Ixl,10Hbuffer2Ixl,质粒 DNA10Ixl,SalI1Ixl,EcoRV1Ixl,总体积 20l,37水浴 3 小时;PCR 鉴定:以 pAdTrack.CMV.elafin为模板,以 P1,P2 为引物行 PCR 扩增,扩增条件同1.2.1;测序鉴定:由上海生工对插入穿梭质粒的elafin 基因片段进行测序鉴定.1.2.6BJ5183 菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd.elafin 参考文献 21.1.2.7 将重组腺病毒质粒 pAd.elafin 转入 DH5c
16、x细菌由于重组质粒在 BJ5183 菌中拷贝数较低且不稳定,故需转入 DH5ot 中进行扩增.1.2.8 重组腺病毒质粒 pAd-elafin 酶切鉴定BJ5183 细菌内同源重组后挑选可疑重组腺病毒质粒转化 DH5ot 后,抽提质粒,进行 PacI 酶切鉴定,酶切反应体系:超纯水 12.3l,10NEBbuffer2Ixl,质粒 DNA5Ixl,100BSA0.2Ixl,Pac10.5Ix1.总体积 20l,37水浴 3 小时.1.2.9 重组腺病毒 Ad-elafin 的包装在含有 100ml/L 胎牛血清的 RPMI1640 中培养 293 细胞.转染前 6 小时将 293 细胞接种于
17、25ml 培养瓶中,使其于转染时融合度约为 50%;转染当天 PacI 酶切重组腺病毒质粒 pAd-elafin4Ixg,乙醇沉淀后溶解于30l 灭菌去离子水中;转染过程参照 Lipofectamine2000 说明书,转染后将培养瓶重置于 37(2 孵箱内孵育 46 小时,于 46 小时后吸出含脂质体.重组腺病毒质粒混合物的培养基,加入 4ml 新的 RP.MI1640(100ml/LFBS)培养基 ;应用 GFP 观察腺病毒生成情况,待细胞病变(Cytopathiceffect,CPE)完全形成后,用细胞刮刮下细胞,加入 100lPBS 反复冻融细胞(共 4 次), 离心留上清为粗制病毒液
18、(Crudevirusliquid,CVL),一 20保存;取 30506CVL 感染 293 细胞,以进一步扩增腺病毒.1.2.10 重组腺病毒 Adelafin 的 PCR 鉴定取 5CVL,加 10 蛋白酶 K,55oC1 小时,煮沸 5 分钟,以 2 为模板,分别以 P1,P2 为引物对 CVL 行目的基因 elafin 的 PCR 鉴定,同时对 pAdEasy 一 1 质粒鉴定 J.引物设计序列为 P3:5 一 CTGTGGACCGTGA0GATA0.P4:5 一 TGrI1GGGCATAG 觚 TGTT 一3,扩增产物长度 759bp,PCR 扩增条件:94C 预变性 3 分钟,9
19、4变性 30 秒,51退火 40 秒,72延伸 4o 秒,34 个循环,72延伸 10 分钟.1.2.11 重组腺病毒 Adelafin 的扩增,收集参考文献2.1.2.12 重组腺病毒 Ad.elafin 的病毒滴度测定将多次感染制备的病毒液作不同比例(1:10 一l:10“)稀释,将 100 稀释液加至预先接种 293 细胞的 96 孔培养板中,37,5%CO:孵箱中 46 小时,换新鲜培养基,继续培养 1824 小时后于荧光显微镜下计数 GFP 阳性细胞数,选择 70%一 80%细胞被感染的孔,按下列公式计算病毒滴度:病毒滴度(pfu/m1)=GFP 阳性细胞数病毒上清稀释倍数/0.1m
20、l.1.2.13 蛋白质印迹杂交法(Westernblot)检测目的基因的表达应用 RIPA 分别提取 Ad.elafin 感染及未感染 293 细胞的总蛋白,Bradford 法蛋白定量,变性后 4og/孔行 10%聚丙稀酰胺凝胶电泳,电转,免疫印迹杂交;一抗稀释比例为 1:200,二抗稀释比例为 l:500;DAB 显色.1.2.14Elafin 蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用初步鉴定首先 ELISA 测定 Adelafin 感染 293 细胞24 小时后细胞上清液 elafin 水平:随后 1p,mol/LNE+原代培养的气道上皮细胞( 培养方法见文献4),Adelatin 感染 293
21、细胞 24 小时后细胞上清液+lpanol/LNE+原代培养的气道上皮细胞分别孵育 24 小时,采用 ELISA 测定两组细胞上清液中黏蛋白水平.2 结果2.1 目的基因 elafin 的克隆提取肺组织总 RNA后,RTPCR 扩增出片段约为 400bp 的条带,经测序为 377bp 的基因 elafin,见图 1.2.2 穿梭质粒的鉴定2.2.1 重组穿梭质粒的双酶切鉴定插入的 elafin基因片段的理论长度为 377bp.pAdTrack.CMV.ela.fin 经 SalI,EcoRV 双酶切后,电泳酶切片段,为一9kb 条带和约 400bp 条带,见图 2.表明重组穿梭质粒 pAdTr
22、aekCMVelafin 构建成功.2.2.2PCR 鉴定重组穿梭质粒以 P1,P2 为引物.穿梭质粒 pAdTrackCMVelafin 为模板行 PCR,扩增出大小约为 400bp 的目的片段,以空载体质粒pAdTrack.CMV 为模板进行 PCR,未扩增出目的条带,见图 3,表明重组质粒中成功插入了 elafin 基因.2.2.3 测序鉴定重组穿梭质粒穿梭质粒pAdTrack.CMV.elafin 由上海生工测序,证明插入片段为 eIfin 基因,重组穿梭质粒构建成功 .2.3 重组腺病毒质粒 pad.elafin 鉴定2.3.1PacI 酶切鉴定重组腺病毒质粒 padelafinBJ
23、5183 细菌内同源重组后挑选可疑重组腺病毒质粒转化 DH5ot 后进行 PacI 酶切鉴定,0.8% 琼脂糖凝胶电泳出现 30kb 和 3.0kb 的 2 个片段,完全符合该同源重组的特点,见图 4,表明腺病毒质粒同源重组成功.2图 1elafm 基因 RT.PCR 电泳结果Fig.1Theei_llgeneRT?PCRfromlungNote:1.DNAmarker;2.ElafingeneRTPCRproduet.图 2 重组质粒 pAdTrackCMVelalFm 的双酶切鉴定Fig.2IdentificationoftherecombinantplasmidpAaTraek.CMV?
24、ei_llbyrestrictionanalysisNote:1.HindIHDNAmarker;2.DNAmarkerDI2000:3.RestruetionenzymedigestionanalysisofpAdTraekCMVelalln;4.ReslruetionenzymedigestionanalysisofpAdTraekCMV.pO0O0OO 啪珈葶;聊咖咖l22.3.2PCR 鉴定重组腺病毒质粒 pAdelatin 以pAd.elatin 为模板,P1,P2 为引物扩增出约 400bp 大小的目的基因 elatin 条带 ,P3,P4 对 pAdEasy 一 1 质粒为模板扩
25、增产物长度 759bp 的条带;而以空载体质粒 pAdTrackCMV 为模板进行 PCR,未扩增出目的elatin 条带,测序结果表明其为 elatin 基因,见图 5.2.4 在 293 细胞内腺病毒产生 Adelafin2.4.1pAdelatin 转染 293 细胞 GFP 的表达 PacI 酶切重组腺病毒质粒 pAdelatin 使其线性化后脂质体转染 293 细胞,24 小时后在荧光显微镜下可见GFP 的表达,随着时间的延长,GFP 逐渐增强,4 天时,几乎 80%的细胞呈 GFP 阳性,见图 6.2.4.2 重组腺病毒 Adelatin 病毒滴度转染 Adelafin 的 293
26、 细胞在荧光显微镜下计数 GFP 阳性细胞数,选择 70%80% 细胞被感染的孔,根据 GFP计数法得出腺病毒的滴度 2.210“PFU/ml.23中国免疫学杂志 2007 年第 23 卷图 5 重组腺病毒质粒 pAdelafin 的 elafin 和 AdEasy-1PCR 鉴定Fig.5ThePCRofelafmandAdFatsy-1fromAd.-elafinplasmidsNote:1.DNAmarkerDL2000;2.PCRofAdEasy-1fragment;3.elafin;4.Negativecontro1.图 6 重组腺病毒质粒 pAd-elafm 转染 293 细胞 4
27、8 小时后.圈 3 重组质粒 pAdTrack-CMV-elafm 的 PCR 鉴定在荧光显微镜下观察到的 GFP表达情况(x200)3ThePCRofpAdTrack_CMV.elafmFig,.6LinearizedpAd.dafm,vastraIlstedint0293cellsNot:1?DNA.“且 fkerDlo0;2?Negaivecontrol;3?PcRpmducarnpli_andGFPexpressi0nwasvisualizedbyflnu.nceedfromplasmidpAdTrack.CMV.elafin.一一 一一microscopyincellsaftertransfection48h(20O)3.030202723224361655794l6
