临床基因扩增检验技术 (14).pdf

1、3 3附 件 4新 型 冠 状 病 毒 肺 炎 实 验 室 检 测 技 术 指 南为 指 导 各 级 疾 控 部 门 和 其 他 相 关 机 构 开 展 新 型 冠 状 病 毒 肺炎 实 验 室 检 测 工 作，特 制 定 本 技 术 指 南。一、标 本 采 集（一）采 集 对 象。新 型 冠 状 病 毒 肺 炎 疑 似 病 例 和 聚 集 性 病 例，需 要 进 行 新 型冠 状 病 毒 感 染 诊 断 或 鉴 别 诊 断 者，或 其 他 需 要 进 一 步 筛 查 检 测的 环 境 或 生 物 材 料。(二)标 本 采 集 要 求。1 从 事 新 型 冠 状 病 毒 检 测 标 本 采 集

2、 的 技 术 人 员 应 经 过 生 物安 全 培 训（培 训 合 格）和 具 备 相 应 的 实 验 技 能。采 样 人 员 个 人防 护 装 备（P e r s o n a l P r o t e c t i v e E q u i p m e n t，P P E）要 求：N 9 5及 以 上 防 护 口 罩、护 目 镜、连 体 防 护 服、双 层 乳 胶 手 套、防 水靴 套；如 果 接 触 了 患 者 血 液、体 液、分 泌 物 或 排 泄 物，应 及 时更 换 外 层 乳 胶 手 套。2 住 院 病 例 的 标 本 由 所 在 医 院 的 医 护 人 员 采 集。3 密 切 接 触

3、者 标 本 由 当 地 指 定 的 疾 控 机 构、医 疗 机 构 负 责采 集。4 根 据 实 验 室 检 测 工 作 的 需 要，可 结 合 病 程 多 次 采 样。3 4（三）采 集 标 本 种 类。每 个 病 例 必 须 采 集 急 性 期 呼 吸 道 标 本（包 括 上 呼 吸 道 标 本或 下 呼 吸 道 标 本），重 症 病 例 优 先 采 集 下 呼 吸 道 标 本；根 据 临 床需 要 可 留 取 便 标 本、全 血 标 本、血 清 标 本。标 本 种 类：1 上 呼 吸 道 标 本：包 括 鼻 咽 拭 子、咽 拭 子 等。2 下 呼 吸 道 标 本：深 咳 痰 液、肺 泡

4、灌 洗 液、支 气 管 灌 洗 液、呼 吸 道 吸 取 物 等。3 便 标 本：留 取 粪 便 标 本 约 1 0 克（花 生 大 小），如 果 不 便于 留 取 便 标 本，可 采 集 肛 拭 子。4 血 液 标 本：尽 量 釆 集 发 病 后 7 天 内 的 急 性 期 抗 凝 血，采集 量 5 m l,建 议 使 用 含 有 E D T A 抗 凝 剂 的 真 空 釆 血 管 采 集 血 液。5 血 清 标 本：尽 量 釆 集 急 性 期、恢 复 期 双 份 血 清。第 一 份血 清 应 尽 早（最 好 在 发 病 后 7 天 内）釆 集，第 二 份 血 清 应 在 发 病后 第 3 4

5、 周 釆 集。采 集 量 5 m l，建 议 使 用 无 抗 凝 剂 的 真 空 釆 血 管。血 清 标 本 主 要 用 于 抗 体 的 测 定，不 进 行 核 酸 检 测。（四）标 本 采 集 和 处 理。1 鼻 咽 拭 子：采 样 人 员 一 手 轻 扶 被 采 集 人 员 的 头 部，一 手执 拭 子，拭 子 贴 鼻 孔 进 入，沿 下 鼻 道 的 底 部 向 后 缓 缓 深 入，由于 鼻 道 呈 弧 形，不 可 用 力 过 猛，以 免 发 生 外 伤 出 血。待 拭 子 顶端 到 达 鼻 咽 腔 后 壁 时，轻 轻 旋 转 一 周（如 遇 反 射 性 咳 嗽，应 停留 片 刻），然 后

6、 缓 缓 取 出 拭 子，将 拭 子 头 浸 入 含 2 3 m l 病 毒 保 存3 5液（也 可 使 用 等 渗 盐 溶 液、组 织 培 养 液 或 磷 酸 盐 缓 冲 液）的 管中，尾 部 弃 去，旋 紧 管 盖。2 咽 拭 子：被 采 集 人 员 先 用 生 理 盐 水 漱 口，采 样 人 员 将 拭子 放 入 无 菌 生 理 盐 水 中 湿 润(禁 止 将 拭 子 放 入 病 毒 保 存 液 中，避免 抗 生 素 引 起 过 敏)，被 采 集 人 员 头 部 微 仰，嘴 张 大，并 发“啊”音，露 出 两 侧 咽 扁 桃 体，将 拭 子 越 过 舌 根，在 被 采 集 者 两 侧 咽

7、扁 桃 体 稍 微 用 力 来 回 擦 拭 至 少 3 次，然 后 再 在 咽 后 壁 上 下 擦 拭 至少 3 次，将 拭 子 头 浸 入 含 2 3 m l 病 毒 保 存 液（也 可 使 用 等 渗 盐 溶液、组 织 培 养 液 或 磷 酸 盐 缓 冲 液）的 管 中，尾 部 弃 去，旋 紧 管盖。咽 拭 子 也 可 与 鼻 咽 拭 子 放 置 于 同 一 管 中。3 鼻 咽 抽 取 物 或 呼 吸 道 抽 取 物：用 与 负 压 泵 相 连 的 收 集 器从 鼻 咽 部 抽 取 粘 液 或 从 气 管 抽 取 呼 吸 道 分 泌 物。将 收 集 器 头 部插 入 鼻 腔 或 气 管，接

8、 通 负 压，旋 转 收 集 器 头 部 并 缓 慢 退 出，收集 抽 取 的 粘 液，并 用 3 m l 采 样 液 冲 洗 收 集 器 1 次（亦 可 用 小 儿 导尿 管 接 在 5 0 m l 注 射 器 上 来 替 代 收 集 器）。4 深 咳 痰 液：要 求 病 人 深 咳 后，将 咳 出 的 痰 液 收 集 于 含 3 m l采 样 液 的 5 0 m l 螺 口 塑 料 管 中。如 果 痰 液 未 收 集 于 采 样 液 中，可在 检 测 前，加 入 2 3 m l 采 样 液，或 加 入 痰 液 等 体 积 的 痰 消 化 液。痰 消 化 液 储 存 液 配 方：成 分 每

9、瓶二 硫 苏 糖 醇 0.1 g氯 化 钠 0.7 8 g氯 化 磷 0.0 2 g3 6磷 酸 氢 二 钠 0.1 1 2 g磷 酸 二 氢 钾 0.0 2 g水 7.5 m lp H 7.4 0.2（2 5）临 用 前 将 储 存 液 以 去 离 子 水 稀 释 至 1 0 0 m l。也 可 以 采 用 痰 液 等 体 积 的 含 1 g/L 蛋 白 酶 K 的 磷 酸 盐 缓 冲 液将 痰 液 化。5 支 气 管 灌 洗 液：将 收 集 器 头 部 从 鼻 孔 或 气 管 插 口 处 插 入气 管（约 3 0 c m 深 处），注 入 5 m l 生 理 盐 水，接 通 负 压，旋 转

10、 收 集器 头 部 并 缓 慢 退 出。收 集 抽 取 的 粘 液，并 用 采 样 液 冲 洗 收 集 器 1次（亦 可 用 小 儿 导 尿 管 接 在 5 0 m l 注 射 器 上 来 替 代 收 集）。6 肺 泡 灌 洗 液：局 部 麻 醉 后 将 纤 维 支 气 管 镜 通 过 口 或 鼻 经过 咽 部 插 入 右 肺 中 叶 或 左 肺 舌 段 的 支 管，将 其 顶 端 契 入 支 气 管分 支 开 口，经 气 管 活 检 孔 缓 缓 加 入 灭 菌 生 理 盐 水，每 次 3 0 5 0m l，总 量 1 0 0 2 5 0 m l，不 应 超 过 3 0 0 m l。7 粪 便

11、 标 本：取 1 m l 标 本 处 理 液，挑 取 黄 豆 粒 大 小 的 便 标本 加 至 管 中，轻 轻 吹 吸 3-5 次，室 温 静 置 1 0 分 钟，以 8 0 0 0 r p m 离心 5 分 钟，吸 取 上 清 液 进 行 检 测。粪 便 标 本 处 理 液 可 自 行 配 制：1.2 1 1 g T r i s，8.5 g 氯 化钠，1.1 g 无 水 氯 化 钙 或 1.4 7 g 含 结 晶 水 的 氯 化 钙，溶 解 至 8 0 0 m l去 离 子 水 中，用 浓 盐 酸 调 节 p H 为 7.5，以 去 离 子 水 补 充 至 1 0 0 0 m l。3 7也

12、可 使 用 H A N K S 液 或 其 它 等 渗 盐 溶 液、组 织 培 养 液 或 磷 酸 盐 缓冲 液 溶 解 便 标 本 制 备 便 悬 液。如 患 者 出 现 腹 泻 症 状，则 留 取 粪便 标 本 3 5 m l，轻 轻 吹 打 混 匀 后，以 8 0 0 0 r p m 离 心 5 分 钟，吸 取上 清 液 备 用。7.肛 拭 子：用 消 毒 棉 拭 子 轻 轻 插 入 肛 门 3 5 c m，再 轻 轻 旋转 拔 出，立 即 放 入 含 有 3 5 m l 病 毒 保 存 液 的 1 5 m l 外 螺 旋 盖 采 样管 中，弃 去 尾 部，旋 紧 管 盖。8 血 液 标

13、 本：建 议 使 用 含 有 E D T A 抗 凝 剂 的 真 空 釆 血 管 采 集血 液 标 本 5 m l，根 据 所 选 用 核 酸 提 取 试 剂 的 类 型 确 定 以 全 血 或 血浆 进 行 核 酸 提 取。如 需 分 离 血 浆，将 全 血 1 5 0 0 2 0 0 0 r p m 离 心 1 0分 钟，收 集 上 清 于 无 菌 螺 口 塑 料 管 中。9 血 清 标 本：用 真 空 负 压 采 血 管 采 集 血 液 标 本 5 m l，室 温静 置 3 0 分 钟，1 5 0 0 2 0 0 0 r p m 离 心 1 0 分 钟，收 集 血 清 于 无 菌 螺 口

14、塑 料 管 中。其 他 材 料：依 据 设 计 需 求 规 范 采 集。（五）标 本 包 装。标 本 采 集 后 在 生 物 安 全 二 级 实 验 室 生 物 安 全 柜 内 分 装。1 所 有 标 本 应 放 在 大 小 适 合 的 带 螺 旋 盖 内 有 垫 圈、耐 冷 冻的 样 本 采 集 管 里，拧 紧。容 器 外 注 明 样 本 编 号、种 类、姓 名 及采 样 日 期。2 将 密 闭 后 的 标 本 装 入 密 封 袋，每 袋 限 一 份 标 本。样 本 包装 要 求 要 符 合 危 险 品 航 空 安 全 运 输 技 术 细 则 相 应 的 标 准。3 83.涉 及 外 部 标

15、 本 运 输 的，应 根 据 标 本 类 型，按 照 A 类 或 B 类感 染 性 物 质 进 行 三 层 包 装。（六）标 本 保 存。用 于 病 毒 分 离 和 核 酸 检 测 的 标 本 应 尽 快 进 行 检 测，能 在 2 4小 时 内 检 测 的 标 本 可 置 于 4 保 存；2 4 小 时 内 无 法 检 测 的 标 本 则应 置 于-7 0 或 以 下 保 存（如 无-7 0 保 存 条 件，则 于-2 0 冰 箱暂 存）。血 清 可 在 4 存 放 3 天，-2 0 以 下 可 长 期 保 存。应 设 立专 库 或 专 柜 单 独 保 存 标 本。标 本 运 送 期 间 应

16、 避 免 反 复 冻 融。（七）标 本 送 检。标 本 采 集 后 应 尽 快 送 往 实 验 室，如 果 需 要 长 途 运 输，建 议采 用 干 冰 等 制 冷 方 式 进 行 保 藏。1 上 送 标 本各 省（自 治 区、直 辖 市）聚 集 性 病 例 的 标 本，上 送 中 国 疾病 预 防 控 制 中 心 病 毒 病 预 防 控 制 所 进 行 检 测 复 核，并 附 样 本 送检 单（见 附 表）。2 病 原 体 及 标 本 运 输2.1 国 内 运 输新 型 冠 状 病 毒 毒 株 或 其 他 潜 在 感 染 性 生 物 材 料 的 运 输 包 装分 类 属 于 A 类，对 应

17、的 联 合 国 编 号 为 U N 2 8 1 4，包 装 符 合 国 际 民 航组 织 文 件 D o c 9 2 8 4 危 险 品 航 空 安 全 运 输 技 术 细 则 的 P I 6 0 2 分类 包 装 要 求；环 境 样 本 属 于 B 类，对 应 的 联 合 国 编 号 为 U N 3 3 7 3，包 装 符 合 国 际 民 航 组 织 文 件 D o c 9 2 8 4 危 险 品 航 空 安 全 运 输 技 术3 9细 则 的 P I 6 5 0 分 类 包 装 要 求；通 过 其 他 交 通 工 具 运 输 的 可 参 照以 上 标 准 包 装。新 型 冠 状 病 毒 毒

18、 株 或 其 它 潜 在 感 染 性 材 料 运 输 应 按 照 可感 染 人 类 的 高 致 病 性 病 原 微 生 物 菌（毒）种 或 样 本 运 输 管 理 规定（原 卫 生 部 令 第 4 5 号）办 理 准 运 证 书。2.2 国 际 运 输新 型 冠 状 病 毒 毒 株 或 样 本 在 国 际 间 运 输 的，应 规 范 包 装，按 照 出 入 境 特 殊 物 品 卫 生 检 疫 管 理 规 定 办 理 相 关 手 续，并满 足 相 关 国 家 和 国 际 相 关 要 求。2.3 毒 株 和 样 本 管 理新 型 冠 状 病 毒 毒 株 及 其 样 本 应 由 专 人 管 理，准

19、确 记 录 毒 株和 样 本 的 来 源、种 类、数 量，编 号 登 记，采 取 有 效 措 施 确 保 毒株 和 样 本 的 安 全，严 防 发 生 误 用、恶 意 使 用、被 盗、被 抢、丢失、泄 露 等 事 件。二、新 型 冠 状 病 毒 的 实 验 室 检 测新 型 冠 状 病 毒 感 染 的 常 规 检 测 方 法 为 实 时 荧 光 R T-P C R。任何 新 型 冠 状 病 毒 的 检 测 都 必 须 在 具 备 条 件 的 实 验 室 由 经 过 相 关技 术 安 全 培 训 的 人 员 进 行 操 作。本 指 南 中 的 核 酸 检 测 方 法 主 要针 对 新 型 冠 状

20、 病 毒 基 因 组 中 开 放 读 码 框 1 a b（o p e n r e a d i n gf r a m e 1 a b，O R F 1 a b）和 核 壳 蛋 白（n u c l e o c a p s i d p r o t e i n，N）。实 验 室 确 认 阳 性 病 例 需 满 足 以 下 两 个 条 件 中 的 一 个：1.同 一 份 标 本 中 新 型 冠 状 病 毒 2 个 靶 标（O R F 1 a b、N）实 时4 0荧 光 R T-P C R 检 测 结 果 均 为 阳 性。如 果 出 现 单 个 靶 标 阳 性 的 检 测结 果，则 需 要 重 新 采 样，

21、重 新 检 测。如 果 仍 然 为 单 靶 标 阳 性，判 定 为 阳 性。2.两 种 标 本 实 时 荧 光 R T-P C R 同 时 出 现 单 靶 标 阳 性，或 同 种类 型 标 本 两 次 采 样 检 测 中 均 出 现 单 个 靶 标 阳 性 的 检 测 结 果，可判 定 为 阳 性。核 酸 检 测 结 果 阴 性 不 能 排 除 新 型 冠 状 病 毒 感 染，需 要 排 除可 能 产 生 假 阴 性 的 因 素，包 括：样 本 质 量 差，比 如 口 咽 等 部 位的 呼 吸 道 样 本；样 本 收 集 的 过 早 或 过 晚；没 有 正 确 的 保 存、运输 和 处 理 样

22、 本；技 术 本 身 存 在 的 原 因，如 病 毒 变 异、P C R 抑 制 等。三、实 时 荧 光 R T-P C R 方 法 检 测 新 型 冠 状 病 毒 核 酸（一）目 的。规 范 实 时 荧 光 R T-P C R 方 法 检 测 新 型 冠 状 病 毒 核 酸 的 工 作 程序，保 证 实 验 结 果 的 正 确 可 靠。（二）范 围。适 用 于 实 时 荧 光 R T-P C R 方 法 检 测 新 型 冠 状 病 毒 核 酸。（三）职 责。检 测 人 员：负 责 按 照 本 检 测 细 则 对 被 检 样 本 进 行 检 测。复 核 人 员：负 责 对 检 测 操 作 是

23、否 规 范 以 及 检 测 结 果 是 否 准确 进 行 复 核。部 门 负 责 人：负 责 对 科 室 综 合 管 理 和 检 测 报 告 的 审 核。（四）样 本 接 收 和 准 备。4 1核 对 被 检 样 本 姓 名、性 别、年 龄、编 号 及 检 测 项 目 等；待检 样 本 的 状 态 如 有 异 常，需 注 明；待 检 样 本 应 存 放 于-7 0 冰 箱保 存。（五）检 测 项 目。1.新 型 冠 状 病 毒 核 酸 测 定（实 时 荧 光 R T-P C R 方 法）推 荐 选 用 针 对 新 型 冠 状 病 毒 的 O R F 1 a b、N 基 因 区 域 的 引 物

24、和探 针。靶 标 一（O R F 1 a b）:正 向 引 物（F）：C C C T G T G G G T T T T A C A C T T A A反 向 引 物（R）：A C G A T T G T G C A T C A G C T G A荧 光 探 针（P）：5-F A M-C C G T C T G C G G T A T G T G G A A A G G T T A T G G-B H Q 1-3 靶 标 二（N）:正 向 引 物（F）：G G G G A A C T T C T C C T G C T A G A A T反 向 引 物（R）：C A G A C A T T T

25、 T G C T C T C A A G C T G荧 光 探 针（P）：5-F A M-T T G C T G C T G C T T G A C A G A T T-T A M R A-3 核 酸 提 取 和 实 时 荧 光 R T-P C R 反 应 体 系 及 反 应 条 件 参 考 相 关厂 家 试 剂 盒 说 明。2.结 果 判 断阴 性:无 C t 值 或 C t 4 0。阳 性：C t 值 3 7，可 报 告 为 阳 性。灰 度 区：C t 值 在 3 7-4 0 之 间，建 议 重 复 实 验，若 重 做 结 果 C t4 2值 4 0，扩 增 曲 线 有 明 显 起 峰，该

26、 样 本 判 断 为 阳 性,否 则 为 阴 性。注：如 果 用 的 是 商 品 化 试 剂 盒，则 以 厂 家 提 供 的 说 明 书 为准。四、病 原 生 物 安 全 实 验 活 动 要 求根 据 目 前 掌 握 的 新 型 冠 状 病 毒 的 生 物 学 特 点、流 行 病 学 特征、临 床 资 料 等 信 息，该 病 原 体 暂 按 照 病 原 微 生 物 危 害 程 度 分类 中 第 二 类 病 原 微 生 物 进 行 管 理，具 体 要 求 如 下：（一）病 毒 培 养。病 毒 培 养 是 指 病 毒 的 分 离、培 养、滴 定、中 和 试 验、活 病毒 及 其 蛋 白 纯 化、病

27、 毒 冻 干 以 及 产 生 活 病 毒 的 重 组 实 验 等 操 作。上 述 操 作 应 当 在 生 物 安 全 三 级 实 验 室 的 生 物 安 全 柜 内 进 行。使用 病 毒 培 养 物 提 取 核 酸，裂 解 剂 或 灭 活 剂 的 加 入 必 须 在 与 病 毒培 养 等 同 级 别 的 实 验 室 和 防 护 条 件 下 进 行，裂 解 剂 或 灭 活 剂 加入 后 可 比 照 未 经 培 养 的 感 染 性 材 料 的 防 护 等 级 进 行 操 作。实 验室 开 展 相 关 活 动 前，应 当 报 经 国 家 卫 生 健 康 委 批 准，取 得 开 展相 应 活 动 的

28、资 质。（二）动 物 感 染 实 验。动 物 感 染 实 验 是 指 以 活 病 毒 感 染 动 物、感 染 动 物 取 样、感染 性 样 本 处 理 和 检 测、感 染 动 物 特 殊 检 查、感 染 动 物 排 泄 物 处理 等 实 验 操 作，应 当 在 生 物 安 全 三 级 实 验 室 的 生 物 安 全 柜 内 操作。实 验 室 开 展 相 关 活 动 前，应 当 报 经 国 家 卫 生 健 康 委 批 准，取 得 开 展 相 应 活 动 的 资 质。4 3（三）未 经 培 养 的 感 染 性 材 料 的 操 作。未 经 培 养 的 感 染 性 材 料 的 操 作 是 指 未 经

29、培 养 的 感 染 性 材 料在 采 用 可 靠 的 方 法 灭 活 前 进 行 的 病 毒 抗 原 检 测、血 清 学 检 测、核 酸 提 取、生 化 分 析，以 及 临 床 样 本 的 灭 活 等 操 作，应 当 在 生物 安 全 二 级 实 验 室 进 行，同 时 采 用 生 物 安 全 三 级 实 验 室 的 个 人防 护。（四）灭 活 材 料 的 操 作。感 染 性 材 料 或 活 病 毒 在 采 用 可 靠 的 方 法 灭 活 后 进 行 的 核 酸检 测、抗 原 检 测、血 清 学 检 测、生 化 分 析 等 操 作 应 当 在 生 物 安全 二 级 实 验 室 进 行。分 子 克 隆 等 不 含 致 病 性 活 病 毒 的 其 他 操 作，可 以 在 生 物 安 全 一 级 实 验 室 进 行。4 4附 表新 型冠 状病 毒 检测 标本 送检 表送 样 单 位（盖 章）：送 样 日 期：年 月 日送 样 人：标本编号标本类型 姓名 性别 年龄 发病日期 就诊日期 采样日期样本来源是否为聚集性病例检测日期实时荧光 R T-P C R 基因序列同源性*备注试剂厂家 靶基因 一代 深度测序基因序列同源性*非必选项，注明完成具体靶基因序列/全基因组序列，及其与新型冠状病毒的同源性。样本来源是否为聚集性病例 填是或否。