1、富硒乳酸菌的分离、筛选、驯化及富硒研究?4?2004 年第 11 期总第 140 期阐邕研究报告富硒乳酸菌的分离,筛选,驯化及富硒研究宋照军,王树宁,潘润淑,李敏,田华(河南科技学院,河南新乡 453003)关键词:嗜热链球菌;富硒:筛选;驯化摘要:从酸奶中分离纯化出保加利亚杆菌(LactobacillusBulgaria,LB)和嗜热链球菌(StreptocociusThermopiles,ST),通过耐硒筛选,确定嗜热链球菌为耐硒菌种,以浓度梯度法对其驯化,从而得到富硒菌株,并进行富硒实验.初步确定富硒条件为:采用蕃茄酵母培养基,接种量 10%,培养温度 39,pH7,第 6小时时加硒,硒
2、浓度为 15g/mE,培养 1lh,富硒率为 72.8%.中图分类号:Q813.5 文献标识码:B文章编号:02545071(2004)11 00040311eisolation,screening,anddomesticationofSe-enrichedlacticacidbacteriaandstudyontheSe-enrichingconditionsS0NGZhao-jtm,wANGShuning,PANRun-shu,LIMin,TIANHua(HenanCollegeofscienceTechnology,Xinxiang453003,China)Keywords:Strept
3、ococcusthermophilus(ST);Seenriching;screening;domesticationAbstract:Lactobacillusbulgaria(LB)andSeptococcusthermophilus(ST)wereisolatedandpmSfiedfromtheyogurt.TheformerwasidentifiedasSetolerantstrainsthroughscreeninganddomesticatedbyincreasingtheSe.concentration.TheSeenrichedstrainswerethusobtaineda
4、ndtheSe-enrichingconditionswerestudiedaswel1.Theresultshowedthat,usingtomato-yeastmedium,inoculationamount:10%,cultivatedtemperature:39oC,pH7,Seaddedtime:6hlater,Seconcentration:15g/mL,cultivatedtime:11h,Seenrichingratio:72.8%.硒是人体必需的微量元素之一,是谷胱甘肽过氧化物酶不可缺少的组成部分,该酶具有清除体内过多的活性氧自由基,提高机体免疫力,抗衰老,抗癌的作用,与人体
5、健康有着密切关系.微量的硒元素能激发人体免疫球蛋白及抗体的产生,保护细胞膜和染色体,以及保护核糖核酸等大分子生理活性物质的结构和功能.其生物医学作用是通过参与组成一种硒酶谷胱甘肽过氧化物酶来实现的【1.该酶在生物体内是一种非常特异性抗氧化剂,具有防御过氧化作用,以维护机体免受过氧化物的损害.而硒的生物化学功能则表现为参与合成辅酶,以维护心脏的生理功能;消除免疫抑制剂,增加免疫能力;对抗异常细胞和致突变作用,对抗生物体内有毒重金属等嘲.因此硒的生物化学和生物医学研究在国内外都得到较快发展,并己成为国内外营养学和医学研究的热点问题.但我国有近 3/4 地区属缺硒地区,生物体内的硒大都来源于蔬菜,水
6、果等,但这些天然食物中硒含量普遍偏低,一般不足 0.01edg,很难满足中国营养学会 1988年推荐的成人硒日摄入量为 50g 的要求 p,从而影响人体内硒的含量和代谢.如果机体细胞长期缺硒而得不到补充,那么与硒相关的代谢过程就会被阻滞而导致某些疾病的发生.研究成果表明,人体的克疝病,大骨节病,癌症,心脑血管病,糖尿病,机体免疫力减退和衰老等 40 余种疾病均与缺硒有关.因此有必要在食物中强化硒含量,向人体补充硒元素,做为防治硒缺乏引起各种疾病及保健的有效措施.由于无机硒的毒性很强,吸收率又低,因此目前补硒都把有机硒视为最安全最有效的手段.研究表明,硒半胱氨酸等有机硒的吸收率高,在体内可贮存,
7、而亚硒酸盐等无机硒的吸收率低,不易在体内贮存.通过生物转化作用将无机硒转化为有机硒,可降低无机硒的毒性,提高硒的生理活性与吸收率.因此,开发有机硒食品给机体提供硒源,也是目前食品科技工作者研究的热点.国内外有关专家都在积极寻求人工补硒的方法.有机硒的获得包括微生物转化法,植物转化法,动物转化法等.在微生物转化法中较多的是培养硒酵母,所用菌种一般为啤酒酵母.而其他微生物的富硒能力未见报道,而乳酸菌是目前发酵食品生产中普遍使用的菌种,其众多的保健功能,良好的风味和可靠的安全性已经被广大消费者所认可.因此本试验试图通过对几种乳酸菌富硒能力的研究,以寻求获得富硒能力优良的乳酸菌菌株和富硒条件,再进一步
8、研究开发富硒的活性乳酸菌功能食品,达到其综合保健功能,维护人们健康.1 材料与方法1.1 菌种从含有保加利亚乳杆菌(LactobacillusBulgaria,简称 LB),嗜热链球菌(StreptococcusThermophilus,简称 ST)的酸奶样品中分离,纯化.1.2 培养基改良番茄汁固体培养基:番茄汁 50mL,牛肉浸膏收稿日期:20040318作者简介:宋照军(1973 一),男,河南辉县人,硕士研究生,研究方向为食品微生物学和功能性食品的研究与开发.研究报告阐邕 2004 年第 11 期总第 140 期?5?10g,葡萄糖 2g,吐温 8Olg,酵母浸膏 5g,乳糖 20g,
9、磷酸氢二钾 2g,醋酸钠 5g,琼脂 15g,加蒸馏水至 1000mL.制法:将新鲜番茄洗净,切碎(切勿捣烂)放入角瓶内,置 4冰箱内 4h-8h,取出后用纱布过滤成番茄汁,将配方各成分加热溶解于蒸馏水中,调 pH 至 6.8,过滤分装,于 121高压蒸气灭菌 15min-20min,备用.改良番茄汁液体培养基:不加琼脂,其余与改良番茄汁固体培养基相川.麦芽糖液体培养基(蔗糖液体培养基):牛肉浸膏5g,蛋白胨 5g,酵母浸膏 5g,吐温 8OO.5mL,麦芽糖(蔗糖)5g,1.6%溴甲酚紫指示剂 1.4mL,加水至 1000mL.制法:先将牛肉膏,酵母膏,蛋白胨,吐温 8O 在水中加热溶解,再
10、加入溴甲酚紫指示剂,分装试管,于 1l4高压灭菌 15min.1_3 试剂Na2SeO350g/mL 及 100g/mL,高压灭菌备用,NaCI,5%NaOH,1:lHC1,CaCO3,0.5%3,3 一二氨基连苯胺(DAB),甲苯,5%EDTA 一 2Na,5%NaOH 溶液,1:1 盐酸,1.6% 溴甲酚紫指示剂等.1.4 仪器SWCJIF 超净工作台,uv 一 1100 紫外可见分光光度计,LRH 一 150B 生化培养箱,1012 鼓风干燥箱,CRDX 一 28 高压蒸气杀菌锅,MDl002 电子分析天平,PHS 一 2C 酸度计 ,YXJ 一 2 台式高速离心机,SN9202426
11、冷冻离心机,血球计数板,显微镜,分液漏斗等.1.5 方法1.5.1 试验流程菌种扩培一分离纯化一菌种鉴别一耐硒能力筛选一耐硒驯化一富硒试验一富硒率测定1.5.2 菌种扩培酸奶在贮藏过程中,菌种活力可能降低,因此需要扩培 1 次,提高菌种活力.用无菌吸管吸取 10mL 酸奶于装有 100mL 脱脂乳的二二角瓶中,37培养至凝乳为止.1.5_3 菌种的分离纯化用吸管吸取上述凝乳后的脱脂乳,以 lO 倍浓度梯度法稀释成适当浓度,吸取 0.1mL 菌液在番茄酵母培养基平板上涂布,37培养 24h.挑取典型单菌落镜检,初步判断菌种类别后,用平板划线法分离纯化得到纯菌落.1.5.4 菌种鉴别观察平板上长出
12、的菌落形态,进行革兰染色和镜检,确认菌体的典型特征.做糖发酵实验对其生化特征进行鉴定,以最终确定菌种类别.将鉴别后的菌种接到斜面上,4E 保藏 .1.5.5 菌种耐硒能力筛选从斜面上挑取适量菌体于生理盐水中制成菌悬液,加入含硒量为 5g/mn,含有 CaCO,的番茄酵母培养基中,混匀倒平板.置于 37培养 24h,观察乳酸菌产酸分解 CaCO,形成透明圈的大小.因为乳酸菌的耐硒能力与透明圈大小成正相关,根据透明圈大小即可筛选出耐硒能力强的菌种.1.5.6 菌株耐硒驯化从斜面上挑取耐硒菌株,依次接到硒浓度为lOg/mE,20g/mn,30g/mE 的液体培养液中,进行硒浓度梯度驯化.每个梯度于适
13、宜温度培养 24h.最后从含硒 3Og/mE 的培养液中挑取菌液于平板上划线分离,纯化 1 次后接斜面保存.1.5.7 富硒试验通过测定耐硒菌生长曲线,确定最佳加硒时间和培养时间.从斜面上挑取已驯化菌株制成菌悬液,活化12h 后,吸取 O.5mL 分别接种于装有 10mL 液体培养基的大试管中,取出 l 管于 4保藏,其余各管在 39恒温培养.此后每隔 lh 取出 1 管 4保藏.待全部取出后 ,用分光光度计在 530nm 波长下测定吸光度.因为吸光度与细胞密度成正相关,由此可确定耐硒菌的生长曲线.1.5.8 适宜硒浓度的测定从斜面上挑取已驯化菌株,于含硒量分别为lOg/mE,12g/mn,1
14、5g/mE,18g/mn,20g/mE 的液体培养基中.适宜温度培养 12h 后,根据菌液颜色变化确定适宜硒浓度.1.5.9 富硒能力测定硒含量的测定:3,3一氨基联苯胺比色法5.硒含量标准曲线的绘制:硒标准溶液:准确称取0.1000g 硒,置于 50mL 小烧杯中,加入 1:1 盐酸 10mL,加热溶解,冷却并转移至 100mL 容量瓶中定容.此溶液lmL 含 lmg 硒,用时可稀释成相当于 lmL 含 1g 硒.标准溶液曲线绘制:准确吸取 1g/mE 的硒标准溶液 0.0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,分别加入分液漏斗中,加水至 35mL 分别加入 5%E
15、DTA 一 2Na 溶液 lmL,摇匀,并用 1:1 盐酸调节溶液 pH 至 2-3,各加O.5%3,3 一二氨基联苯胺(DAB)溶液 4mL,摇匀,置于暗处 30rain,再用 5%NaOH 溶液调节至中性,加入 10mL甲苯振摇 2rain,静置分层,弃去水层.甲苯层通过棉花栓过滤于比色皿中,置于分光光度计 420nm 波长处测定吸光度.绘制标准曲线.残留无机硒含量的测定:在装液体培养基量为40mL 的 250mL 三角瓶中,以 lO%接种量接入驯化 3 代的富硒菌株,在富硒试验确定的富硒条件下培养后,测定其富硒能力.取适量样品,lO000ffmin 高速离心机离心 30min,取 20m
16、L 上清液,加水至 35mL,加入 2mL5%EDTA 一 2Na 溶液,以下同标准曲线 .根据样品测得的吸光?6?2004 年第 11 期总第 140 期阐邕研究报告度,从标准曲线中查得相应的硒含量,则为无机硒含量.有机硒含量的测定:有机硒含量=总硒含量一残留无机硒含量富硒能力(有机硒转化率):有机硒转化率/%=(有机硒含量/总硒含量)xlO02 结果与讨论2.1 菌种分离与鉴定对分离纯化的杆菌和球菌进行菌落形态观察,革兰染色后观察菌体形态,并做糖发酵试验,结果见附表.附表鉴别结果菌种菌落特征菌体特征革兰染色由附表可知,1 为嗜热链球菌(StreptococcusTher-mophilus,
17、简称 ST),2 为保加利亚杆菌(LactobacillusBulgaria,简称 LB).2.2 菌种间耐硒筛选观察培养 24h 的加有 CaCO 的平板,发现嗜热链球菌产生的透明圈直径与菌径之比较大,因此可确定其为耐硒菌种.2.3 耐硒驯化观察传接 3 代的球菌驯化菌液,发现菌体变红.这是因为球菌通过生物转化作用,将无机硒转化为单质硒而使菌体变红.挑取驯化菌液于平板上划线分离.39培养 24h 后,菌体又呈微白色.由此得到在不含硒培养基上正常生长的耐硒菌株.2.4 富硒试验2.4.1 加硒时间和培养时间的确定(见图 1)由图 1 可知,嗜热链球菌在 5h-8h 处于对数期,8h-1lh 处
18、于稳定期.因对数期菌体代谢旺盛,转化率高 ,衰亡期菌体大量自溶,转化率低,且加硒时间越早对菌体代谢活动抑制越强,从转化率和生产周期考虑,选择第 6 小时为加硒时间,培养时问为 llh.1?00.80.60.40.20l2345678910lll2l3时间/Il图 1 嗜热链球菌的生长曲线2.4_2 适宜硒浓度的确定观察不同硒浓度的液体培养基,发现随硒浓度增加,菌体变红有增加趋势.20g/mE 时红色较深,l8g/mE 微红,l5g/mE 红色不明显.为避免过多无机硒转化为单质硒,提高有机硒转化率,确定 l5g/mL 为最佳硒浓度.2.5 富硒能力测定2.5.1 硒标准溶液曲线(见图 2)1.0
19、0.80.60?40.20246810硒浓度/gomL图 2 硒浓度工作曲线2.5.2 富硒率计算在 420nm 波长下测得样液的吸光度为 0.387,于是由图 2 的标准曲线可得样液的硒浓度为 4.08g/mE,则由转化率计算公式可得,经富硒试验后的嗜热链球菌的富硒率为 72.8%.3 结论本实验筛选出嗜热链球菌(eptococcusTher-mophilus,简称 ST)为耐硒菌株,经驯化后进行富硒试验,采用蕃茄酵母培养基,接种量 10%,培养温度为39,pH7,培养第 6 小时加硒,硒浓度 l5g/mE,培养时间 1lh,可得到富硒嗜热链球菌,其富硒率为 72.8%.参考文献:【1】谢丽
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