1、国产冻干人凝血酶原复合物质量标准的研究150 中国生化药物杂志 ChineseJournalofBiociemicalPharmaceutics2004 年第 25 卷第 3 期又会使工作周期延长,因此选择 0.5BV/h 为宜,用 4BV 的洗脱剂即可将组分洗脱完全.10090镁蓝馨窨7010152025床体积/BV图 8 洗脱剂浓度对树脂上 PDG 洗脱效果的影响a.40%乙醇;b.30%乙醇;e.20%乙醇冰斟莲馨0凸lj40床体积/BV图 9 洗脱剂流速对树脂上 PDG 洗脱效果的影响a.0.5BV/h;b.1BV/h;C.1.5BV/h综上所述,s.8 大孔吸附树脂对杜仲中重要活性成
2、分 PDG(上柱液浓度 800mg/L)进行分离富集的适宜工艺条件为,吸附:室温,流速 2BV/h,溶液处理量为 6BV,上柱液 pH 值在 811 范围;洗脱:洗脱剂为 40%乙醇水,流速 0.5BV/h,洗脱剂用量为4BV,批.采用该工艺进行平行实验 5 次,收集所需组分,分别在旋转蒸发仪上浓缩,除去有机溶剂,冷冻干燥,得到淡黄色晶体供试品.通过高效液相色谱分析,取其平均值,并与原料对比,结果如下:产品中PDG 含量38.5%,而原料中为 0.085%,PDG 的过柱得率为 85.5%.采用该法显着富集,纯化产品,效果良好.与传统的萃取法比较,大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少,节省
3、动力消耗和能量消耗,从而大幅度降低成本等优点.参考文献:1中国药科大学.中药辞海(第二卷)M. 北京:中国医药科技出版社,2001.145150.2Charlesjs,RavikumarPR,HuangFC.Isolationandsynthesisofpinoresinoldiglucoside,amajorantihypertensiveprincipleofTuChung(eucommiaulmoideoliver)J.JAmChemSoc,1976,98(17):54125413.3DeyamaT.Theconstituentofeucommiaulmoidesolive.I.Isol
4、ationof(+)一 medioresinolDio-13 一 DglucopyranosideJ.ChemPharmBull,1983,31(9):29932997.4史作清,施荣富 ,范云鸽,等.树脂吸附法在中草药有效成分提取中的应用J.中草药,2001,32(7):66O 一 662.5徐世芳,毛丽珍 .大孔吸附树脂及其在中药化学成分中的应用J浙江省医学科学院,2001,12(2):45.47.6钱骅,赵伯涛 ,张卫明.杜仲叶绿原酸的提取分离J.中国野生植物资源,2001,20(4):15-16.国产冻干人凝血酶原复合物质量标准的研究沈琦,郝杰,盛凤仙,李,王坚,马力(1.中国药品生物
5、制品检定所,北京 100050;2.上海新兴医药股份有限公司 ,上海200135;3.中美合资上海莱-3=血制品有限公司,上海 200246;4.华兰生物工程股份有限公司 ,河南新乡453003)摘要:目的通过对国产人凝血酶原复合物(PCC)质量的研究,建立与国际接规的质量标准.方法用人凝血因子,X(FI1,F,F,FX) 浓制荆国家标准品,采用一期法测定国内用不同原料制备的 PCC 中 FI1,F,F,FX 的效价;用正常人血浆作标准 ,用凝固法检测 PCC 的总效价及 PCC 中的肝素.结果用血浆作原料提纯制备的 PCC,FIv 的效价能达到 10IU/ml 以上,F效价最低; 用组分 m
6、 作原料,F活性损失很大,只有 2/7 批次能达到 10IU/ml;而 F效价最高.无论用何种原料,FI1 和 FX 活性均能保持在一定水平.结论从血浆中直接提纯制备 PCC,能有效地保持 FlV 活性,各项指标易达到国外同品种的质量标准 .关键词:人凝血因子 lI;人凝血因子;人凝血因子 IX;人凝血因子 X;人凝血酶原复合物中图分类号:IO9233 文献标识码:A 文章编号:1005 1678(200403.0150.04收稿日期:20030526;修回日期:20030908作者简介:沈琦(1959 一), 女 ,浙江奉化人,理学硕士,副研究员.研究方向为血液制品的质量控制.;8中国生化药
7、物杂志 ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2004 年第 25 卷第3 期 15lStudiesonthequalitystandardoffreezedriedhumanprothrombincomplexconcentratemadeinChinaSHENQi,HAOJie,SHENGFeng.xian,LILing2,WANGJian,MAIj4(1.NationalInstituteforControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China;2.ShanghaiXi
8、nxingMedicalCo.,Ltd.,Shanghai200135,China;3.ShanghaiRAASBloodProductsCo.,Ltd.,Shanghai200246,China;4.HualanBiologicalEngineeringCo.,Ltd.,Xinxiang453003,China)Abstract:PurposeTostudyonthequalityofhumanprothrombincomplexconcentratesoastoestablishthesamequalitystandardastheinternationalstandardofPCC.Me
9、thodsThepotenciesofcoagulationfactorU.VII, andXpresentinPCCpreparedfromdifferentstartingmaterialswereassayedagainstthenationalstandardbyone-stageclottingmethod.ThetotalpotencyofPCCwasassayedagainstthenormalhumanplasmabyclottingmethod.HeparinpresentinPCCwasassayedbyclottingmethod.ResultsThepotencyofF
10、IVinPCCpreparedfromhumanplasmasourcecanreachmorethan10IU/ml:ThepotencyofFisthelowest.ThepotencyofFIXinPCCpreparedfromfractionIlllostgreatlyandonly2/7batchescanreachmorethan10IU/ml:ThepotencyofFVIIisthehighest.ThepotenciesofF1IandXcanmaintainthecertainlevelsnomatterwhichstartingmaterialsareused.Condu
11、sionThePCCpreparedfromhumanplasmasourcecaneffectivelymaintainthepotencyofFIV.TheotheritemscaneasilyreachtheinternationalstandardofPCC.Keywords:humancoagulationfactorU;humancoagulationfactorfactorVII;humancoagulationfactorfactorIX;humancoagulationfactorfactorX;humanprothrombincomplexconcentrate冻干人凝血酶
12、原复合物(PCC)的有效成分主要由凝血因子,X(FII,F,FIX,FX)4 种凝血因子组成.该产品的质量标准收载在中国生物制品规程2000 年版暂行规程中.对其有效性控制采用测定 4 种凝血因子的总效价,即用血浆当量单位(PE) 表示.但总效价的测定方法不能反应每种凝血因子的实际效价,所以需对每一种凝血因子的效价进行测定.中国药品生物制品检定所抽检了已有生产批准文号的 4 家血制品企业生产的 l4 批PCC,对其有效成分 FU,FVII,F,FX 的效价和总效价进行了检测,同时对其安全性指标如肝素进行了检测.1 材料冻干 FU,FVII,FIX,FX 浓制剂国家标准品 (同一制剂复合物,其中
13、含 FU,FVII,F,FX 分别为l6.06,l5.O3,lO.4,l2.06IU/支),中国药品生物制品检定所,批号:20010620.PCC 供试品,14 批,A,B,C,D4 家血制品企业生产,其中 7 批用组分作原料制备,另外 7 批用原料血浆作原料制备而成,均为冻干品.缺 F1I,F,FIX 和 FX 血浆 (用时分别加纯化水 1ml 复溶),Thromboplastin 试剂( 用时加纯化水 4rnl 复溶),美国 PacificHemostasis 公司,;APTF 试剂(用时加纯化水 9ml 复溶),美国 InternationalLabola.tory 公司.ACL200
14、全自动凝血仪,意大利 InstrumentationLaboratory 公司.Thrombotrack4 半自动凝血仪,挪威NYC0MED 公司.2 方法与结果2.1FH,F“vl,F和 FX 的效价测定国家标准品用纯化水 1.0ml 溶解,供试品按标示量加纯化水溶解.标准品和供试品分别用缺F1I,F,FIX 和 FX 血浆作预稀释到 1Iu/rnl.FU,F和 FX 测定时用巴比妥缓冲液(pH7.3, 含 1%人血白蛋白)作 1:10,1:20,1:40 稀释.F测定时用咪唑缓冲液(pH7.3,含 1%人血白蛋白 )作 1:10,1:2O,1:40 稀释.均用一期法测定,用 3,3 平行线
15、法计算效价.PCC 中 FU,FVII,F,FX 效价和总效价结果见表 1.2.2 其他项目检测PCC 总效价,肝素含量和蛋白质含量按 2000 版中国生物制品规程要求测定.比活结果见表 2,肝素含量见表 3.2.3PCC 测定结果的比较结果见表 4.3 讨论152 中国生化药物杂志 ChineseJoumalofBiociemicalPharmaceutics2004 年第 25 卷第 3 期表 1PCC 中 F,F,F ,FX 效价和总效价表 3 肝素含量测定结果2002 版欧洲药典对 PCC 的质量标准有效性控制要求分别测定 F ,F,F和 FX 的效价,并规定 F的效价大于 2OIu/
16、m1,比活(F1U/mg蛋白质含量)大于 0.6,肝素的加量应小于 0.5U 肝素/FIu. 产品规格用 F 的效价表示.我国现行的 PCC 质量标准与欧洲药典比较,存在以下不同:有效性控制采用测定 4 种凝血因子的总效价;未对比活作规定;肝素的加量应不中国生化药物杂志 ChineseJournal0fBiochemicalPharmaceutics2004 年第 25 卷第3 期 153表 4 中国药品生物制品检定所与各厂家 PCC 测定结果的比较A(组分 FllI)B(组分 FllI)(原料血浆)20011241A020011242A0200l1243A0200203o4200203052
17、00203062002O601200206022002060320020704C(原料血浆)试 1试 2试 3高于 1.0U 肝素/PE;产品规格用总效价表示.制备 PCC 的原料不同,对 PCC 中 4 种凝血因子的含量有很大的影响.国外生产 PCC 主要采用血浆作原料和组分 I 沉淀后的上清血浆或去冷沉淀后的上清血浆为原料.采用血浆作原料,用 DEAESephadex 吸附制备 PCC,能有效保证 4 种凝血因子的含量,仅 FVII 含量较低,一般为 57IU/ml,这与我们报道的结果一致.国内血制品企业生产 PCC 的原料主要采用低温乙醇法分离的组分(FIII) 沉淀,制备工艺基本上用
18、PEG 沉淀和 DEAESephadexA 一 50 吸附.用组分为原料制备的 7 批 PCC,F的效价均小于 20IU/ml.比活大于 0.6 仅 2 批;肝素加入量用 FIX 的效价计算,全部过量.所以用组分为原料生产 PCC,其 F的效价指标很难达到欧洲药典的要求.主要原因是 FIX 经几步低温乙醇分离后部分活性丢失,在组分中含量不高.用原料血浆提取的 7 批PCC,有 3 批 FIX 的效价大于 20IU/ml,其余 4 批基本上都在 10Iu/m1 以上;比活和肝素含量全部达到欧洲药典的要求.很明显在制备 PCC 工艺相同情况下,用原料血浆制备 PCC 优于组分.中国药品生物制品检定
19、所与各厂家测定 PCC总效价和 4 种凝血因子效价的结果基本一致,仅个别批次差异较大,这些差异主要是实验操作不规范引起的.我们发现在 F效价很低的情况下对总效价的测定无影响;我们在另外的研究中测定 F浓制剂时,发现 FIX 效价很高,其他 3 种凝血因子很少时,总效价为零.说明 F效价高低对总效价测定无影响.与体内凝血机理是吻合的.在无 F时,F ,F,FX 可以通过外源性凝血途径参与凝血.在只有 F,而缺乏其他 3 种凝血因子时,F参与的内源性凝血途径发生中断,所以测不出总效价.国产 PCC 在临床使用已近 20 年,治疗先天性或获得性缺乏上述 4 种凝血因子的出血性疾病,特别是治疗先天性缺
20、乏 F的乙型血友病的出血症状 ,疗效很好.国产 PCC 的质量也在逐步提高,中国生物制品规程2ooo 版暂行规程增加了两个安全性指标如肝素含量和激活凝血因子.在今年的规程修订中将增加有效性控制的项目如 F,F ,FIX,FX的效价,使我国的 PCC 标准逐渐与国际标准接规,从而确保更安全有效.参考文献:1中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程暂行规程(2000 版 )【M. 北京:化学工业出版社,2000.24.30.2沈琦,云志宏 ,刘大英,等.第一批人凝血因子浓制剂国家标准品的协作标定J.中国生物制品学杂志,2001,14(1):42-43.3沈琦,任跃明 ,刘大英,等.首批人凝血因子和 X 浓制剂国家标准品协作标定J.中国生化药物杂志,2002,23(4):166-168.4沈琦,任跃明 ,刘大英,等.第一批人凝血因子浓制剂国家标准品协作标定J.中国生物制品学杂志,2002,15(4):243244.5周海均,申蕴如 ,朱承伟,等.生物检定统计方法M.北京:人民卫生出版社,1983.110-132.6EuropeanPharmac0poeiaSupplementS.1998.341342.欢迎订阅中国生化药物杂志镐叭 m 刚列捌姗似鼹嘶;魄m 謇 i 跚湖博;詈撇伽螂啪加ml2l12l1llm瑚姗仍m 姗奶謇
