1、环氧化酶2 在食管癌中表达的初步研究环氧化酶2 在食管癌中表达的初步研究Abstract：Objective To research the cyclooxygenase2 protein expression and its effect in the esophagus cancer. Methods 34 cases of esophagus cancer specimens ere examined the expression of COX2 by immunohistochemical method and Western blotting method. Results The
2、significant positive rates of COX2 expression in esophagus cancer as 71%,but the significant positive expression in the adenocarcinoma and squamous carcinoma is not significant difference.Statistics test shoed that the age,gender,tissue differentiation,clinical stageand node metastasis did not affec
3、t the COX2 significant expression in esophagus cancer. Conclusion The COX2 protein significant positive expression may be closely associated ith the occurrence,form and development of the esophagus cancer.Key ords：Cyclooxygenase2; Esophagus squamous cancer; Esophagus adenous cancer摘要：目的 研究环氧化酶2 （cyc
4、looxygenase2, COX2 ）在食管癌中的表达情况，探讨其在食管癌发展中作用。方法 应用免疫组织化学方法和 Western blotting方法检测 34例食管癌中 COX2的表达情况。结果 COX2 约在 71%的食管癌中显著表达，其中鳞癌及腺癌的显著表达之间无统计学显著性差异。并且统计学检验表明肿瘤的临床病理特征中，年龄性别、组织分化程度、临床分期（TNM）以及有无淋巴结转移对食管癌中的 COX2 的显著表达无明显影响。结论 COX2 在食管癌中的表达显著增高，临床意义尚未明确。关键词：环氧化酶2 ； 食管磷癌; 食管腺癌0 引言 流行病学资料研究表明,长期坚持服用非甾体类抗炎药
5、可使大肠癌的危险性降低 40%50 %1,使家族性腺瘤性息肉病的癌变率和死亡率降低。NSAIDS 作用机制在于抑制环氧化酶2 的活性2 。临床及实验研究表明，COX2 在机体大多数正常组织中无表达，但在多种肿瘤组织中表达增高。国内外已有学者开始研究COX在食管癌中的表达意义。本实验旨在研究 COX2 在食管癌组织中的表达情况，并探讨其与食管癌的发生、发展与转移的关系。1 材料和方法1.1 材料 选自本院 2001年 8月2002 年 4月间手术切除并经病理检查证实的食管癌组织标本 34例，其中鳞癌 28例，腺癌 6例。组织标本切除后于 30min内取癌组织一块立即置入液氮中速冻后储存于-80冰
6、箱保存备用，取远离癌组织的正常组织送病理检查,另取正常组织一小块以上述方法保存。1.2 试剂 羊抗人 COX2 多克隆抗体（购于 Santa Cruz公司，美国）SP kit（购于 ZYMED公司，美国） ，APES。Trozol 试剂，考马斯亮蓝 G250 染料，PVDF 膜（德国罗氏公司） 。1.3 辣根过氧化酶标记的 SP 法 即石蜡切片常规脱蜡至水, 3%过氧化氢 甲醇封闭 5min，PBS 漂洗后置柠檬酸中，微波炉抗原修复5min，PBS 漂洗后依次滴加一抗 4过夜,二抗 37 15min,辣根酶标记的链霉卵白素工作液 15min，PBS 漂洗后 DAB 显色,自来水充分冲洗终止反应
7、,苏木素复染,脱水,透明,封片。1.4 对照及评估方法 以平滑肌细胞和血管内皮细胞为阳性对照，以 PBS代替一抗作阴性对照。按以下肿瘤细胞染色阳性率比例记分：为 0计分为 0，1%10%记分为 1，11%50%记分为 2，51%80%记分为 3，81%100%记分为 4。1.5 分级标准 0（无表达） ，14，58，912， 512。1.6 Western Blotting杂交 将组织制成匀浆，室温静置 10min，离心后取下层酚氯仿相，提取蛋白质； 用 Bradford法测定蛋白质浓度；将含等量蛋白质的样品与 3加样缓冲液以 21 的体积比混合，煮沸 5min后上样行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶
8、电泳，正常组织和癌组织同时上样做对照，同时点 5l BioRad 预染蛋白质标准作为分子量参照，垂直电泳分离蛋白质；将蛋白质通过电转移转至 PVDF膜上；以含 5%脱脂奶粉的 TBST 室温封闭 23h，山羊抗人COX2 多克隆抗体 4摇动过夜，辣根酶偶联的兔抗山羊 IgG抗体，室温轻摇 23h。 2 结果 COX2 的阳性染色主要是胞浆染色，其主要表达于癌组织中，而正常组织中除平滑肌细胞、血管内皮细胞外基本无表达, 以平滑肌细胞、血管内皮细胞的 COX2 表达为对照标准。 COX2 在约 70%的食管癌中显著表达，无统计学检验显著性差异。并且统计学检验表明肿瘤的临床病理特征中，年龄、性别、组
9、织分化程度、临床分期（TNM） 、有无淋巴结转移对食管癌中的 COX2 的显著表达无明显影响，见表 1、2。表 1 COX2 在食管癌中的表达情况（略） Western blot 检测COX2 在肿瘤组织中和正常组织中的表达情况，见图 1。 其中15 泳道为鳞癌，第 6泳道为腺癌的表达情况，每一癌组织泳道配一正常组织泳道对照。 图中可见到 COX2 在食管癌组织中明显表达，而正常组织中则无表达或轻微表达， Western blotting 检测到 COX2 的表达情况和免疫组化标本中的表达情况基本一致。表 2 食管癌 COX2 显著表达与临床特征的关系（略）图 1 Western blot检测
10、食管癌组织和正常组织 COX2 蛋白表达（略） 3 讨论 环氧化酶是分解花生四烯酸、生成各种内源性前列腺素过程中重要的限速酶。目前认为 COX 有两种类型：COX1 和COX2 。前者为结构型 COX，在多数组织细胞中持续低浓度表达，并参与维持机体正常的生理功能；后者为可诱生型 COX,在正常生理状态下多数组织内检测不到，而当细胞受到炎症等刺激后便开始表达合成。近年来研究表明,COX2 与一些肿瘤的发生、发展和转移有关3 。 COX2 在肿瘤中的意义首先明确于结肠肿瘤和直肠肿瘤。随后的研究逐渐发现在全身其他部位的肿瘤中也有不同程度的表达。目前多数学者认为,COX2 的过度表达与肿瘤特别是消化系
11、统肿瘤的发生、发展有密切关系4,5 。 本研究表明 COX2 在食管癌中显著表达，其中鳞癌及腺癌的显著表达分别为 71%与 67%，而癌旁组织中则无表达或轻微表达，这与同类研究结果一致，提示COX2 表达异常可能是食管癌发病过程中发生的重要分子改变。本研究提示 COX2 的表达程度与食管癌分化程度相关性无统计学差异，但有文献提示食管癌的分化程度越高，其 COX2 表达越强 6 ，认为 COX2 的表达可能主要存在于较为成熟的肿瘤细胞，其差异可能由于本组低分化食管癌例数太少，影响其统计学检验。发生淋巴结转移的患者 COX2 的染色分数为 5.7000.868，而在无淋巴结转移病例中 COX2 的
12、染色分数为 5.5710.912，统计分析不支持 COX2 的表达程度与有无淋巴结转移间存在相关性，但国内有关 COX2 表达与淋巴结转移的关系报道不一，具体原因尚不清楚，仍需进一步研究。虽然我们研究发现临床分期对食管癌中的COX2 的显著表达无明显影响，但 Shamma 等7对日本食管癌患者研究发现：COX2 在食管鳞状上皮重度异型增生的组织中表达最强，依次强于原位食管癌和浸润性食管癌，这可能与肿瘤基因调控的复杂性以及地区差异等多方面因素有关。关于 COX2 与食管癌发生的阶段，仍需进一步探讨，以便明确 COX2 抑制剂可否对食管癌前病变起阻断作用。 本实验研究结果表明 COX2 在食管癌中表达显著升高， 其在肿瘤的发生、 发展中可能发挥着重要作用， 因此COX2 抑制剂可能通过抑制 COX2 的活性来发挥其抗食管癌的作用。 其进一步研究将为肿瘤的化学预防和靶向治疗提供新的策略与途径。【参考文献】 1 Thun MJ. NSAID use and decreased risk of gastrointestinal cancers. Gastro enterol Clin North Am,1996, 25 :333348. Marx J. Antiinflammatories inhibit cancer groth but ho.Science
