1、硫酸铍对小鼠体外脾淋巴细胞 DNA 损伤的剂量效应硫酸铍对小鼠体外脾淋巴细胞 DNA 损伤的剂量效应【摘要】 目的：观察不同剂量硫酸铍（BeSO4）在不同时相处理后引发小鼠体外脾淋巴细胞的 DNA 链断裂损伤的剂量效应. 方法：采用单细胞凝胶电泳法 g, 68 k 龄,二级动物,宁夏医学院实验动物中心提供. 硫酸铍（BeSO44H2O, SigmaAldrich 公司); 胎牛血清研磨,200 目筛网过滤,用 RPMI 1640 完全培养液将其稀释成1108 个/L 细胞悬液5.1.2.2 细胞染毒分别取脾淋巴细胞 6 份于试管中, 1 管加完全培养基作阴性对照,其余 5 管各加入不同浓度的
2、BeSO4 溶液,使终浓度分别为 0.2, 2.0, 20.0, 100.0, 200.0 mol/L,置 37恒温水浴振荡器孵育 1 h;同样设 6 管同上染毒 2 h 后检测. 染毒完毕后用台盼蓝染色观察染毒后的细胞存活率大于 90%.1.2.3DNA 链损伤的检测参照 Singh 法6, 制片： 分别取 125 mg 低溶点琼脂糖（LMA）和正常溶点琼脂糖（NMA）溶于 25 mL 无Ca2+, Mg2+磷酸缓冲液（PBS）中，制备成 5 g/L LMA 和 5 g/L NMA. 在 56下，将 100 L 5 g/L NMA 浇注到全磨砂载玻片上，盖上盖玻片置 4，10 min 使琼脂
3、糖固化. 在 37下，将 50 L 细胞悬液与 50 L 10 g/L 新鲜配制的 LMA 混匀，4固化；再取 75 mL 5 g/L LMA 铺至第二层琼脂糖上，置 4，10 min 固化;裂解、解旋、中和：将载玻片浸入 4冷裂解液（2.5 mol/L NaCl; 100 mmol/L EDTA; 10 mmol/L Tris）中裂解 1 h，电泳缓冲液中避光放置 20 min；25 V， 300 mA 电泳 20 min，TrisHCl （pH 7.5）中和 3 次，用 50 L 5 mg/L 碘化丙锭（PI）溶液染色; 分析：荧光显微镜下使用 590 nm 的绿色激发光进行观察，数码相机
4、拍照，每份样本随机拍摄 50 个 DNA 受损细胞，将拍摄的图像输入计算机（图像设置为300400 象素进行分析） ， 运用 CASP 软件计算彗星细胞的尾长、 尾矩、 Olive 尾矩及尾部 DNA 百分含量. 统计学处理： 用 SPSS 11.5 统计软件包进行方差分析.2 结果21 染毒后 DNA 损伤的“彗星”形态学观察染色后在荧光显微镜察 20 倍镜下观察可见, 阴性对照组的淋巴细胞大小比较均一，为一圆形荧光团，荧光强度均匀，边缘光滑，即彗星头部，无拖尾现象（图 1A）. BeSO4 染毒作用时,损伤细胞的 DNA 迁移表现为彗星头部核心致密、周边松散,呈刷状缘样；并且随着 BeSO
5、4 剂量的增加，彗星的尾巴加长，尾部的荧光强度增强，彗星头部的直径随着尾部的加长而减小（图 1B,C,D,E,F）.A：阴性对照组；B：0.2 mol/L 组；C：2 mol/L 组；D：20 mol/L 组；E：100 mol/L 组；F：200 mol/L 组. 图 1 硫酸铍致小鼠脾淋巴细胞 DNA 受损形态 略2.2 染毒不同剂量 DNA 链损伤的检测 BeSO4 染毒 1 h 和 2 h 时所致DNA 链损伤出现的尾长及尾矩与对照组相比 ,各剂量组显著增加.表 1 硫酸铍致小鼠脾淋巴细胞 DNA 损伤的指标（略）3 讨论铍及其化合物是一种严重危害人类健康的金属污染物，人类对其研究已有
6、几十年，但至今有关它的毒作用机制尚未清楚. 已知铍及其化合物可损害机体的免疫系统,但是否是由于 DNA 的损伤而导致淋巴细胞功能异常，国内外未见相关报道. SCGE 是在单细胞水平上检测有核细胞 DNA 损伤和修复的分子生物学毒性评价方法. DNA 的损伤和肿瘤的发生有一定的关系,由于 SCGE 对低水平的 DNA 损伤极为敏感,因此可用于人类遗传损伤的生物监测,特别是作为职业有害因素对健康影响的早期监测指标具有很好的应用前景. 通常情况下，DNA双链以组蛋白为核心盘旋形成核小体，在核小体中 DNA 为负超螺旋结构，如果有去污剂进入细胞，核蛋白被浓盐提取，DNA 便形成残留的类核. 如果类核中
7、 DNA 断裂，就会在核外形成一个 DNA 晕轮，DNA 断裂将引起超螺旋松散，电泳时 DNA 断片向阳极伸展，形成特征性的彗星尾. DNA 受损越严重，含断裂片段越多，彗星尾就越长，尾中 DNA 百分含量和尾长就成了 DNA 断裂的重要指标. 对于 DNA 损伤的彗星图像分析，目前国内主要采用肉眼观察测定尾长及人工判断 DNA 损伤程度，由于各实验室条件不同，操作人员对细胞 DNA 损伤判断标准不统一，因此主观性强，精确度不够. 我们采用国外CASP 彗星图像分析软件，综合考虑形状、距离、强度、矩类四方面后选择分析了彗星尾部 DNA 百分含量、彗星尾长、尾矩和 Olive 尾矩 4 个指标，
8、不仅省时省力，而且直观、准确7. 淋巴细胞被体外染毒硫酸铍 1 h, 0. 2 mol/ L 时就导致靶细胞的 DNA 损伤,且与其浓度呈明显的剂量效应关系;随着染毒作用时间的增加,DNA 链损伤略有加重,但未见时间效应关系. 硫酸铍在低浓度下对淋巴细胞具有刺激作用. 我们在细胞毒性试验基础上选择对细胞无明显毒性的浓度作为最高受试浓度进行 SCGE 试验, 结果表明, 0.2200 mol/L 的硫酸铍均能在体外引起小鼠脾淋巴细胞 DNA 损伤, 且呈明显的剂量 效应关系. 本实验结果提示, 低浓度硫酸铍尽管未对细胞存活率产生明显毒性, 但可导致 DNA 损伤. 在硫酸铍毒性作用发生过程中, DNA 损伤可能起着非常重要的作用. 可以推测, 正是由于 DNA 损伤, 导致淋巴细胞免疫功能的异常, 进而影响机体的免疫功能, 但目前尚缺乏
