1、鸟嘌呤核苷交换因子 Dock180 与 Elmo1 在卵巢癌细胞中的共表达 (张 瑜 1，高一萌 1，李文燕 1，彭慧娟 1，刘 斌 2，王 辉 1，令狐华 1（400016 重庆，重庆医科大学：附属第一医院妇产科 1，基础医学院病理科）【摘要】 目的 寻找卵巢癌细胞中鸟嘌呤核苷交换因子 Dock180 与 Elmo1 呈相互协同作用的依据。方法 采用 Western blot 检测人卵巢癌组织、良性肿瘤组织及正常卵巢组织中的 Dock180 与 Elmo1 的表达水平；免疫组化检测卵巢癌组织中Dock180 与 Elmo1 的的分布；免疫荧光检测 Dock180 与 Elmo1 在卵巢癌细胞
2、 SKOV3 中的定位分布；检测 Dock180 表达缺失的SKOV3 细胞中内源性 Elmo1 的表达水平。结果 Dock180 与 Elmo1 在人卵巢癌组织中的表达水平呈明显正相关（ r=0.829， P0.05）。卵巢癌组织中，Elmo1 蛋白的表达水平显著高于卵巢良性肿瘤组织和正常卵巢组织，其相对灰度值分别为0.8640.114、0.3740.076、0.3000.105，差异具有统计学意义（ P0.05）。Rac1 在 3 种卵巢组织中的表达水平一致，差异没有统计学意义。2.2 免疫组化检测 Dock180 与 Elmo1 蛋白在卵巢癌组织中表达具有一致性虽说我们没有检测到组织分化
3、程度与 Dock180 及 Elmo1表达水平之间具有显著相关性，但同一标本中二者表达强度表现出明显一致性。如图 2 所示，在卵巢癌组织中检测到Dock180 与 Elmo1 蛋白的表达，并且这两种蛋白均主要定位于细胞胞膜和胞浆，为棕黄色或棕色颗粒，呈弥漫性分布。2.3 Dock180 与 Elmo1 在卵巢癌 细胞株 Skov3 中的定位分布 如图 3 所示，Dock180 主要分布于细胞胞膜以及胞膜皱褶等特化结构，胞浆中也有少量分布。同时 Elmo1 也表现出相似的分布。二者融合以后，定位重叠，其细胞内定位分布表现出一致性。用SiRNA干扰SKOV3细胞株中内源性表达的Dock180蛋白，
4、建立Dock180表达缺失型细胞株Dock180i-SKOV3。Dock180i-SKOV3细胞中Dock180的表达（0.2250.101）与对照组（1.0640.131）相比，蛋白降低78.85%。Dock180表达缺失型细胞株构建成功（图4a，b）。在Dock180表达缺失的细胞中，我们检测到Elmo1的表达水平也随之降低，Dock180i组中Elmo1蛋白表达水平（0.2020.103）与对照组（0.7660.175）相比，蛋白降低73.6%（图4）。在Dock180i-SKOV3细胞株中Dock180和Elmo1的表达水平呈正相关（ r=0.531， P0.05）。Dock180Ra
5、c1-ActinElmo1180kDa130kDa23kDa42kDa1 2 3 4 5 6A00.20.40.60.811.21.41 2 3Dock180Elmo1Rac11卵 巢 癌 组 织 恶 性 2卵 巢 良 性 肿 瘤 组 织 3卵 巢 正 常 组 织Ba bA: Western blot 14: 卵巢癌组织; 5: 卵巢良性肿瘤组织; 6: 正常卵巢组织;B：半定量分析 a:P0.05,与良性肿瘤组织、卵巢正常组织比较；b：P0.05, 与良性肿瘤组织、卵巢正常 组织比较 图 1 Western blot 检测 Dock180 、Elmo1 及 Rac1 蛋白在 3 种卵巢组织中
6、的表达A BC DA: 高分化卵巢癌中Dock180的表达;B: 高分化卵巢癌中 Elmo1的表达;C低分化卵巢癌中中Dock180的表达;D: 低分化卵巢癌中 Elmo1的表达 图2 免疫组化检测Dock180、Elmo1蛋白在卵巢癌组织中的表达（S-P 100）A B CA：红色荧光为 Dock180，B：绿色荧光为 Elmo1，C：二者融合后为黄色荧光。图 3 激光共聚焦检测 Dock180 、Elmo1 蛋白在卵巢癌细胞株中的分布 2.4 Dock180 表达缺失型 SKOV3 细胞中 Dock180、Elmo1 蛋白表达及相互关系ADock180-ActinElmo11 2 3 41
7、80kDa130kDa42kDa00.20.40.60.811.21.41 2 3 4Dock180Elmo1Ba bA：Western blot 1 对照组 SKOV3 2 阴性质粒 SKOV3 3 空质粒 SKOV3 4 Dock180iSKOV3 ;B:半定量分析：a:p0.05,与 1 对照组 SKOV3、2 阴性质粒SKOV3、3 空质粒 SKOV3 比较； b：p0.05,与 1 对照组 SKOV3、2 阴性质粒 SKOV3、3 空质粒 SKOV3 比较图 4 Western blot 检测 Dock180 、Elmo1 蛋白在 SKOV3 细胞中的表达3 讨论恶性肿瘤发生浸润和转
8、移的首要条件是肿瘤细胞动力的增加，而这种变化与细胞信号传导有着密切关系 1。小分子GTP连接酶Rac1参与了细胞移动的调控，在细胞丝状伪足、片状伪足、粘着斑的形成中具有重要的作用。鸟嘌呤核苷酸交换因子Dockl80位于细胞内信号结合物蛋白Crk的上游，能与Crk的SH3结构域特异性的结合，将上游的细胞内信号传递给下游的小分子GTP酶Rac1，并通过激活Rac1而参与调节细胞骨架、细胞增殖等重要生理过程，如果在细胞信号传导中出现效应酶Rac1异常激活，则可能会导致肿瘤的发生 12,13。我们的实验结果显示卵巢组织中总的Rac1表达水平都不低，与Dock180及Elmo1表达强度似乎没有关联。提示
9、作为二者下游蛋白的Rac1, 其表达总量是不受上游激活蛋白Dock180/Elmo1的影响的。受影响的应该是与GTP结合的活性形式。因为Rac1酶活性测定需要新鲜卵巢癌组织或新鲜提取的细胞，我们目前还没有能在组织中证实Dock180/Elmo的共表达与Rac1酶活性之间的相关性。不过，Dock180/Elmo1共表达与Rac1酶活性之间的正相关在Dock180表达缺失性SKOV3细胞中已得到验证(参考文献 4及本文)。 既往研究认为Elmo1通过不同的途径激活并稳定细胞内Dock180的活性，包括：协助Dock180稳定Rac,缓减Dock180的自我抑制并促进Dock180定位于细胞膜以便于
10、更容易接近其靶向目标Rac 10；以及作为Dock180泛素化抑制剂，延缓细胞内Dock180 的降解 11。而 Dock180对Elmo1是否具有调控作用则没有相关报道。我们前期免疫组化结果提示，鸟嘌呤核苷酸交换因子Dockl80在卵巢交界性肿瘤中表达开始逐渐增高，在卵巢癌中明显增高，提示Dock180可能参与了卵巢癌癌变的早期过程 14。通过RNA沉默敲低卵巢癌细胞SKOV3的内源性Dock180表达阐明Crk/Dock180/Rac1信号通路在卵巢癌细胞SKOV3恶性潜能中的作用 4,5。考虑到Elmo1对Dock180的正向调节作用以及二者协同作用对恶性肿瘤侵蚀能力的促进作用 15,1
11、6，我们对这两种蛋白在卵巢癌细胞/组织 中的表达进行了检测。结果验证了二者在卵巢癌细胞及组织均存在共表达且卵巢癌组织中表达明显高于卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织，二者在卵巢癌细胞中的定位分布也是一致的，提示Dock180与Elmo1蛋白在卵巢癌发生发展中的协同作用。此外，我们对前期构建之Dock180表达缺失SKOV3细胞的Elmo1蛋白进行检测，发现对Dock180表达敲低后，其协同蛋白Elmo1表达也明显受阻。该现象提示，Dock180与Elmo1之间的协同作用应该是相互的，除了已知的Elmo1对Dock180的促进作用 16，Dock180对Elmo1同样具有正向调节作用。但其正向调节作用的
12、具体机理还有待进一步阐明。Elmo1与Dock180在卵巢癌组织中共表达，及卵巢癌细胞中二者相同的定位分布，提示在卵巢癌发生发展过程中，二者可能对对方的细胞内活性维持都具有正向调控作用。参考文献：1 Chambers A F, Groom A C, MacDonald I C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sitesJ. Nat Rev Cancer, 2002, 2(8): 563572.2 Hasegawa H, Kiyokawa E, Tanaka S, et al. DOCK180, a major CR
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