1、基于 mtDNA Cytb 的六种果实蝇的分子鉴定（双翅目：实蝇科）昆虫 ActaEntomologicaSinica,June2005,48(3):386390ISSN04546296基于 mtDNACytb 的六种果实蝇的分子鉴定(双翅目: 实蝇科)朱振华,叶辉,张智英(1.云南大学生命科学学院,昆明 650091;2 云南省农业科学院粮作所 ,昆明 650205)摘要:本研究首次对果实蝇属的桔小实蝇 Bactroceradorsal,瓜实蝇 B.cucurbitae,南瓜实蝇 B.tau,番石榴实蝇 B.correct,具条实蝇 B.scutellata,黑漆实蝇 B.scutellar
2、is 等 6 种实蝇 mtDNACytb 基因进行了测序.对这 6 种实蝇 72 个个体 mtDNACytb 基因中段 420bp 的碱基序列进行分析,得到 38 种单倍型,发现了 116 个变异位点,其中 30 个位点较为稳定.对这 6 种实蝇与其各自鉴别位点的对应关系研究表明,mtDNACytb 基因可以作为这 6 种实蝇种类鉴别的分子标记.关键词:双翅目;实蝇科;果实蝇属;线粒体 DNA;细胞色素 b 基因;分子鉴定中图分类号:9969 文献标识码:A 文章编号:04546296(2005)03038605MolecularidentificationofsixBactroceraspe
3、cies(Diptera:Tephritidae)basedonmtDNAZHUZhenHua,YEHui,ZHANGZhiYing(1.CollegeofLifeSciences,YunnanUniversity,Kunming650091,China;2.InstituteofCrops,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kunming650205,China)Abstract:ThemtDNACytbgenesof6fruitflyspecies,includingBactroceradorsalis,B.cucurbitae,B.correcta,
4、B.tau,B.scutellataandB.scutellaris,weresequenced.BasedontheanalysisofmtDNACytb420bpsequencesfrom72individualsofthe6species.weidentified38haplotypesanddetectedl16variablesites,ofwhich30variablesiteswerehighlyconserved.Thestudiesoftherelationshipbetweenthe6fruitfliesandtheirrespectiveidentificationsit
5、essuggestedthatmtDNAcytbsequencescouldbeusedasthemolecularmarkerinidentificationofthe6fruitflyspecies.Keywords:Diptera;Tephfitidae;Bactrocera;mtDNA;cytochromebgene;molecularidentification果实蝇属 Bactrocera 昆虫隶属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae),俗称实蝇 (fruitfly),多为农业害虫,可危害 250 余种水果和蔬菜,目前主要分布于非洲,亚洲的部分地区,澳大利亚及南太
6、平洋的热带地区(汪兴鉴 ,1995;梁广勤等,1996).实蝇类昆虫对寄主瓜果的危害主要表现为:成虫产卵于寄主瓜果内,在瓜果表面形成产卵孔;幼虫蛀食瓜果果肉,导致受害瓜果变质腐烂(Ye,2001; 施伟和叶辉,2004).由于实蝇类昆虫寄主范围广,繁殖力强,危害性大,因而被许多国家列为重要的检疫性害虫(SoutnwoodandComins,1976;汪兴鉴,1995;陈乃中,1998).云南位于热带和亚热带地区,是我国西南地区重要的边境口岸.桔小实蝇 Bactroceradorsalis,瓜实蝇 B.cucurbitae,南瓜实蝇 B.tau,番石榴实蝇 B.correcta,具条实蝇 B.s
7、cutellata 和黑漆实蝇 B.scutellaris 等,是该地区进口瓜果蔬菜中常见的害虫种类,如何防止该类昆虫随同进境瓜果传人国内是当地检验检疫部门的一项重要工作(蒋小龙,2002).迄今为止,对实蝇类昆虫的鉴别主要依据其成虫外部形态特征,但从受害瓜果中截获到的实蝇多数是卵和幼虫,而多数果实蝇的卵和幼虫在形态学上无明显差别,难以进行种类鉴定.因此,检疫部门只能将检疫截获到的果实蝇饲养到成虫后,才可能基于其形态鉴别特征确定其种类.显然,这一检疫程序费时耗力,难以满足进口瓜果快速通关的要求.2004 年以来,我国与东南亚在水果蔬菜上实行零关税贸易,进出口农产品猛增,尽快探讨一套快速,准基金
8、项目:国家重点基础研究发展规划项目(2003CB415100);国家自然科学基金项目(30260023); 云南省自然科学基金项目 (2003C0007M)作者介绍:朱振华,男,1970 年生,硕士,从事昆虫分子生态方面的研究 ,Email:zhzhh86126.cOm*通讯作者 Authorforcorrespondence,E-mail:yehuiynu.edu.ca收稿日期 Received:200411-12;接受日期 Accepted:200504153 期朱振华等:基于 mtDNACytb 的六种果实蝇的分子鉴定 387确,有效的实蝇鉴定技术已势在必行.采用分子生物学技术开展昆虫种
9、类鉴定,可以解决不能通过果实蝇卵,幼虫形态特征进行种类鉴定的问题.上世纪 80 年代以来,同工酶,染色体核型以及 DNA 探针等分子生物技术已经被用于多种昆虫的鉴定研究(Berlocher,1980;DrewandHardy,1981;梁广勤等,1994;Davideta1.,1994). 动物mtDNA 属母系遗传,为双链闭环结构,基因序列组成相对保守,无重组和单拷贝,并易于检测.昆虫mtDNA 平均进化速率是单拷贝核 DNA 的 12 倍,长度为 15.4kb 到 16.3kb 左右,包括 1213 个编码蛋白质的基因.由于其结构和进化上的特点,mtDNA 多被作为研究物种进化的重要分子标
10、记(Vigilaneta1.,1991;张亚平和施立明,1992;施伟和叶辉,2004).在 mtDNA 各基因中,Cytb 基因的结构和功能研究得比较清楚(Moritzeta1.,1987;Gray,1989),因其碱基序列稳定性较高而常用于动物类群的系统进化和分类鉴定研究(JermiinandGrozier,1994;Sheppardeta1.,1996;Davideta1.,1998;任竹梅等,2003).本研究以桔小实蝇,瓜实蝇,南瓜实蝇,番石榴实蝇,具条实蝇和黑漆实蝇等 6 种实蝇作为研究对象,通过对这 6 种实蝇 mtDNACytb 基因序列的测定和对比分析,探讨利用 Cytb 基
11、因序列开展实蝇昆虫分子鉴定的可行性,为下一步构建各种实蝇昆虫的快速分子鉴定和检测技术积累基础资料.1 材料和方法1.1 供试样品本研究采用的桔小实蝇,瓜实蝇,南瓜实蝇,番石榴实蝇,具条实蝇和黑漆实蝇均为成虫干标本,其采集地点,时间及数量等如表 1 所示.表 1 供试实蝇种类,数量,及采集的时间和地点Table1Species,numbersandlocalitiesofthetestedinsects1.2 总 DNA 提取供试实蝇经 TE(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH9.0)缓冲液浸泡 2448h,用无菌水清洗,单头分别放人 1.5mL 的 Eppendoff 管中
12、,用匀浆器将其磨碎,然后参照关秀杰等(2004)采用的酚/氯仿法,逐一提取各实蝇个体总 DNA,将各实蝇个体总DNA 样品置于一 20冰箱中保存,备用.1.3PCR 扩增及序列测定扩增的目的片段为 mtDNACytb 基因中段长度为 433bp 的一段序列.用于扩增 Cytb 基因片段的引物是 CB1 和 CB2(Simon,1994),其序列分别为:CB1:5 一 TATGTACTACCATGAGGACAAATATC 一 3:CB2:5 一 ATIACACCTCCTAATrrATIAGGAAT 一 3.弓 l物由上海申友生物技术有限公司合成.PCR 反应的总体积为 50L,其中含有 5L10
13、Buffer,4LMgz(25mmol/L),1.5p.LdNTP,弓 l 物(10pmol/L)各 4L,0.4LTaqDNA 聚合酶(5U/L),2L 模板 DNA.扩增条件为 94C 预变性 2min,接着进行 35 个热循环:94变性 1min,44退火 1min,72oC 延伸 1.5min,最后在 72充分延伸 5min,同时,以 ddHO 代替模板 DNA 作空白对照.扩增产物的大小,纯度和亮度用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测.PCR 粗产物的纯化及测序委托上海申友生物技术有限公司完成.测序反应均在 ABIIO0377测序仪上进行.1.4DNA 序列数据处理用 DNAstar 软
14、件中的 Editseq 程序进行序列编辑,用 DNAStar 软件中的 MegAlign 程序进行 DNA 同388 昆虫 ActaEntomologicaSinica48 卷源序列排列,并人工核对校正.通过 MEGAversion2.1(Kumareta1.,2001)软件统计确定 6 种实蝇在Cytb 基因部分序列间的碱基替换数,基于 Kimura 一 2 一Parameter 双参数模型分析,并计算出各实蝇种问遗传距离.采用 DNAStar 软件中的 MegAlign 程序,基于 CLUSTAL 程序,对同种实蝇不同个体之间的 Cytb序列遗传差异进行分析.2 结果经电泳检测表明,用引物
15、 CB1,CB2 扩增得到的PCR 产物中没有外源 DNA 污染或外源 DNA 核拷贝,测序结果标明所获得的基因序列为 mtDNACytb表 2Tabie2区序列.本研究得到的这 6 种实蝇的 mtDNACytb基因序列已在 GenBank 中注册 ,其登录序列号见后 .2.16 种实蝇种间关系遗传分析表 2 展示了 6 种实蝇之间的平均遗传距离,碱基替换数及种内个体间序列差异.6 种实蝇在所测Cytb 基因碱基序列上存在差异,其碱基替换数为 1337,遗传距离在 0.059240.19133 之间.同种实蝇不同个体之间,DNA 碱基序列差异较小,且相当稳定,遗传距离为 00.019(表 2)
16、.上述表明,基于mtDNACytb 基因的碱基序列,可以将这 6 种实蝇区别开来,即 Cytb 基因序列可以作为这 6 实蝇分子鉴别的依据.6 种实蝇 Cytb 基因序列的碱基替换数(对角上)和遗传距离 (对角下)及种内序列差异(对角线 )Numberofsubstitution(abovediagona1)andgeneticdistance(belowdiagona1)between6Bactroceraspecies,andsequencedifferencefalongdiagona1)withineachBaclroceraspecies2.2 基因位点分析用 DNAStar 软件对
17、 6 种实蝇 72 个个体的 Cytb基因序列加以排序比较,最终从 433bp 基因序列中获得各实蝇个体较为完整 420bp 的序列片段.对该序列片段分析发现了 116 个变异位点,检测到 38个单倍型.这 38 个单倍型序列已在 GenBank 中注册,注册序号分别为 AY953488AY953506,AY912185AY912188,AY956582AY956590 和AY956592AY956595.这 116 个变异位点无任何碱基的插入和缺失,其中 30 个位点非常稳定,可以作为信息鉴别位点.经综合对比分析表明,这 30 个信息鉴别位点可以将这 6 种实蝇逐一区分出来.如在表 3 中,
18、位点 87,225,506,342 和 402 能将桔小实蝇与其他 5 种实蝇区分开来;位点 45,120,141,162 和185 能将瓜实蝇与其他实蝇区分开;位点 198 和 213可将南瓜实蝇从其他 5 种实蝇中区分辨出来;位点69,70,228,261,282,313,319,357 和 382 可把番石榴实蝇与其他实蝇区分开;位点 102,105,177 和 408 则可把具条实蝇与其他实蝇区分开.位点 24 能同时区分桔小实蝇和瓜实蝇;位点 500 和 375 能同时区分桔小实蝇和番石榴实蝇;位点 312 能同时区分瓜实蝇和南瓜实蝇.位点 90 是唯一能区分黑漆实蝇与其他实蝇的鉴别
19、位点.3 讨论随着现代分子生物技术的发展,利用特定 DNA片段对生物进行种类鉴定,已经成为再次或深入认识生物种分类地位及种问亲缘关系的一个重要手段.基因片段或信息位点是区分生物种类的辅助工具之一,已逐步应用于动植物种类鉴定中.李正西和沈佐锐(2002) 利用 rDNAITS2 序列探讨了赤眼蜂属不同种分子鉴定的可行性.Fushimi 等(1996)对人参属 3 种药用植物人参,西洋参和竹节参的 18SrDNA 基因片段进行了测序分析,发现其中 4 个基因位点可用于人参及相关药材鉴定.Ngan 等(1999) 利用核糖体 ITS15.8SITS2 的 DNA 序列对人参属 6 种药用植物以及 2
20、 种常见的人参伪品紫茉莉和商陆进行了有效鉴定.Zhao 等(2001)应用 rDNAITS 序列鉴定了山姜属红豆蔻及其同属相似种.王建云等(1996)通过对鸡内金和鸭内金的 mtDNACytb 基因约 143bp 片段的分析发现,该片段的 36 个碱基对可3 期朱振华等:基于 mtDNACytb 的六种果实蝇的分子鉴定 389D 以作为区分鸡内金和鸭内金的分子标记.目前,将基因位点作为信息位点进行物种鉴定,在植物上用得较多而在动物上用得较少,利用 mtDNACytb 基因序列探讨果实蝇分子鉴定迄今尚无报道.本文通过对桔小实蝇,瓜实蝇,南瓜实蝇,番石榴实蝇,具条实蝇和黑漆实蝇等 6 种实蝇 mt
21、DNACytb 基因序列的对比分析表明,该基因片段的 30 个基因位点具有较高的稳定性,可以作为上述 6 种实蝇分子鉴定的依据.鉴于这 6 种果实蝇的 mtDNACytb 基因在部分序列上差异较大,可以考虑将其作为实蝇分子遗传标记进一步加以研究,如设计特异性引物,限制性酶切分析,以及在其他果实蝇中进行同基因片段的对比分析等.本项研究的积极意义在于利用 mtDNACytb 基因序列对 6 种实蝇分子鉴定的可行性进行了探讨.更重要的是,本研究为构建PCR 特异性鉴定引物的设计,并根据变异位点设计PCR.RFLP 鉴定实蝇技术提供了必要的基础数据,而这将是我们下一步研究工作的重点.应用特定DNA 序
22、列鉴定桔小实蝇及其近缘种,比传统形态学,细胞遗传学和生物化学(染色体核型分析,同工酶电泳技术等)等方法有更多的优点,如:不要求标本完整,不受活体标本的限制,也不会因虫态和组织器官不同而异.DNA 测序是对遗传物质的直接分析,可以排除蛋白质分析等由于基因在表达过程中可能发生的变化而引起的差异.由此,分子生物学鉴定方法可以成为其他昆虫种类鉴定方法的重要补充.致谢总 DNA 的提取和 PCR 扩增等是在云南省工业微生物发酵工程重点实验室进行的,实验得到云南大学生物系施伟硕士,沙涛实验师,陈善元博士,以及张宏瑞博士的帮助,施伟对本文的修改提供了宝贵的意见和建议,谨此致谢.390 昆虫 ActaEnto
23、rnologicaSinica48 卷参考文献(References)BerlocherSH,1980.AnelectrophoresiskeyfordistinguishingspeciesofthegenesRngD(Diptera:Tephritidae)aslarvae,pupaeoradults.Ann.Entomo1.Soc.Am.,73(2):131137.ChenNZ,1998.Insectofquarantinefruitflies(Diptera:Tephritidae).PlantQuarantine,12(5):298.陈乃中,1998.具有检疫意义的果实害虫实蝇科(部
24、分属种).植物检疫,12(5):298DrewRAI,HardyDE,1981.Dneus(Bactrocera)opiliae,anewsiblingspeciesofthedorsa/seomplexoffruitfliesfromNorthernAustralia(Diptera:Tephritidae).J.Aust.Ent.Soc.20:l31137.DavidH,TinaT.ChariT,1994.DNAprobesvanbeusedtodiscriminatebetweentephritidspeciesatallstagesoflifecycle(Diptera:Tephrit
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27、研究.昆虫,47(2):152158JiangXL,2002.RiskanalysisofquarantinefruitfliesalongYunnanborder.J.SouthwestAgri.Uni.24(5):4O2405.蒋小龙,2002. 云南边境检疫性实蝇风险分析研究.西南农业大学,24(5):402405JermiinLS,CrozierRH,1994.TheeytochromebregioninthemitochondrialDNAoftheantTetraponerurufoniger:sequencedivergenceinHymenopteramaybeassociat
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