1、女性泌尿生殖道解脲支原体基因分型的研究解脲支原体( ureap lasma urealyticum, UU)是引起泌尿生殖道炎症(NGU)及男女不孕不育的主要病原体,也是性传播的常见病原体。目前临床中常见对宫颈分泌物检测出解脲支原体的妇女投以大量抗生素,结果是解脲支原体反复出现阳性,称之为“解脲支原体耐药”,因此下生殖道内查到解脲支原体者,是否皆须诊治,一直尚未完全定论。现在对特定血清型的 UU 具有致病性,这种条件致病病原体进一步分群分型是判断感染与携带的关键。故解脲支原体的基因分型研究成为国内外研究热点,现将其研究进展综述如下:1 解脲支原体概述UU 是从人体中分离的能自身繁殖的 13 种
2、支原体之一,属硬壁菌门柔膜体纲支原体目支原体科脲原体属。1954 年由 Shepard 首先从非淋球菌性 NGU 患者的尿道中分离出来,称为 T 株( tiny strain) 。UU 介于病毒和细菌之间,是在人工培养基上能繁殖的最小的原核细胞型微生物,无细胞壁,能自我复制, 呈球杆状, 大小为 125 250 毫微米, 分子量4. 5 108 ,具高度多形性,是人类泌尿生殖道的一种常见寄生微生物。1992 年 Kong 认为 UU 具有保守的氨基末端和具有多重重复基因的羧基末端,UU 的重复顺序短( 10 氨基酸)但是数目众多。UU 的 MBA 抗原(multip le2banded ant
3、igengenes,多带抗原)决定簇模拟了人类蛋白质来避免被识别,UU 的 MBA 抗原在支原体和宿主的关系中起了关键作用。MBA 抗原有如下特征: 是被感染病人中认识的最主要抗原; 具有种特有性; 具有型特异性及交叉活性片段,能被型特异性单抗及交叉活性单抗所识别; 不但产生于体内,也产生于体外; 负责解脲支原体某一型的高变异型; 在侵袭性解脲支原体分离物中存在,并具有表达大小的差异。UU在遗传学上是“节俭”的而毒力较小的,利用宿主排泄废物(尿素)的能力使其能够在宿主体内保持高水平的生物种群 1 。特异性抗体能抑制 UU 生长,因其缺乏坚硬的细胞膜,对青霉素耐药,对细胞膜有亲和性,生长繁殖时需
4、要类固醇物质。2 解脲支原体的致病机理UU 致病机理是: 具有致病性的 UU 可黏附在上皮细胞、红细胞、巨噬细胞、精子等易感宿主细胞膜表面的受体上,黏附后释放有毒的代谢产物如过氧化物和氨等,同时通过宿主细胞膜获得脂质和胆固醇,引起细胞膜的损伤,导致宿主细胞染色体异常,影响蛋白质和 DNA 合成,严重者导致细胞死亡。UU 具有多种酶活性,与其毒力相关的是脲酶、IgA蛋白酶、凝脂酶 A2、溶酶体; 宿主免疫力低下,性行为不良或性伙伴多变。目前认为 UU 与人体的 NGU 2 、非特异性尿道炎、生殖道感染 3 、赖特综合症、不孕不育、流产、早产 4, 5 、早产儿呼吸窘迫综合征 6 胎膜早破、绒毛膜
5、羊膜炎 7 、胎儿感染与出生低体重儿 8 、死胎 9 新生儿的脑脊髓膜炎等感染、产后发热、膀胱泌尿系结石、播散性感染等有关,在免疫低下病人 UU 可引起脓肿和化脓性关节炎 10 。而新生儿尤其是极低体重出生儿的鼻咽、支气管及肺部也可以检测到 UU,并认为其可以引起新生儿的呼吸系统疾病,是新生儿的死亡率增加,是慢性呼吸系统疾病的一种重要病原体 11213 。UU 在性成熟无症状的女性宫颈或阴道中的分离率达 40% 80% ,作为人群即便经过抗生素介入,降低其携带率,经过一段时间的正常性行为,携带率也会恢复原来水平。而且生殖道的UU是否具有致病性尚存在争议。3 解脲支原体的基因分型UU 根据分子生
6、物学特征可分为两大生物群及 14 个血清型,生物一群包括基因组较小的 1、3、6、14 型,曾先后命名为U. Parvum 群、 Biovar 1 群、 biovar B 群、parvo biovar 群,目前被重新命名为 Ureap lama Parvum, 简称 Up, 占支原体感染的90%92%;生物二群包括剩下的 10 个基因组较大的血清型,也曾先后命名为 T960 群、T2960 biovar 群、biovar2 群、biovarA 群,目前被重新命名为 Ureap lama urealyticum,简称Uu,占支原体感染的 8% 10%。生物二群还可分为 3 个亚群,亚群 1 为血
7、清型 2、5、8、9;亚群 2 为血清型4、10、12、13;亚群 3 为血清型 7、11。XX 年在 Fanrong 等的研究中,为进一步阐明不同血清型的关系,他们把 Uu 的 10 个血清型的MBA 基因 5端和 Up、Uu 的所有血清型基因的部分重复区域进行排序,Uu 的 10 个血清型被分为 5 个 MBA 基因型,MBA基因型 A 包括血清型 2, 5, 8;MBA 基因型 B 包括血清型 10;MBA 基因型 C 包括血清型 4、12、13,MBA 基因型 D 包括血清型 9;MBA 基因型 E 包括血清型 7、11 。在每一种 MBA基因型成员间没有排列顺序的差异。在 Rober
8、tson 14 的研究中血清型 3 标准株被作为 Up 的典型株,Uu 的典型株是血清型 8。在极个别情况下,极少数 UU 菌株的特性不符合任何一个生物种群,例如血清型 3 标准株吸附红细胞的能力、还有膜外板层、磷脂酶 A、磷脂酶 C、细菌敏感性都没有确立与那一个生物种群有关。多克隆的抗血清对一或多个抗原决定簇引起的细胞生长抑制与人类的生物一群有关,但与任何生物二群的抗原荧光分析决定子无关。4 解脲支原体基因分型方法4. 1 抗原检测法4. 1. 1 免疫荧光试验这是最早使用的检测抗原方法,在固体培养的菌落上加入特异的荧光标记的一抗或二抗,在荧光显微镜下观察结果。该法简便易行可以对生长在同一培
9、养基表面的混合血清型株进行鉴定,主要用于 UU 临床标本的血清分型,其缺点是结果不易区分荧光染色的菌落和未染色的菌落,受主观因素的影响较大,且需要特殊的荧光显微镜不易普及使用。4. 1. 2 免疫酶试验这种检测抗原方法与免疫荧光相似,也可以用于检测同一培养基上的不同血清型。该法用酶标记抗体代替荧光抗体,可以在普通显微镜下观察结果。4. 1. 3 免疫结合试验这种检测抗原方法的关键一步是采用硝酸纤维素膜作为载体,利用该膜对蛋白质较好的吸附力,并与免疫酶方法相结合完成对支原体表面抗原的检测。该法易进行大量临床标本的支原体鉴定及同一固体培养基上混合株型鉴定,可以对固体培养基上生长不良的菌落进行鉴定,
10、具有较高的特异性,敏感性与培养法相当,在分型研究中交叉反应的发生率较高。4. 1. 4 免疫印迹技术这种检测抗原方法的基本原理是蛋白质首先被高分辨力十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS2PAGE)分离,蛋白质的各分离区带被固定于凝胶的网络结构中,然后经电转染技术将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上,与敏感而特异的固相免疫测定相结合,利用各种标记试剂灵敏而简便的测出各种特异性反应。4. 2 抗体的测定4. 2. 1 代谢抑制试验原理是 UU 在液体培养集中反应,可分解尿素产生氨,培养基的 PH 值升高,通过颜色指示剂显示。如果将特异的抗体加入液体培养集中,UU 的生长会受到抑制,从而间接抑制了颜色
11、变化。该法有较高敏感性和特异性,被广泛用于UU的分型和 UU 抗体的检测,但交叉反应的发生率较高。4. 2. 2 酶联免疫吸附试验这种检测抗原方法是以溶解的 UU 膜蛋白为抗原,抗原与检测的血清中特异的抗体结合后,再与酶标记的抗人IgG(或 IgM)抗体反应通过酶与底物的反应呈现的颜色来定性定量判断结果。该法具有高特异性高敏感性较好的可重复性,广泛用于 UU 的血清学研究。4. 3 分子生物学方法4. 3. 1 脱氧核糖核酸探针这种检测抗原方法可直接快速(12 天)检测泌尿生殖道标本,特异性高,可以和培养法结合用于 UU 的检测。4. 3. 2 聚合酶链式反应法聚合酶链式反应法( PCR)是目
12、前最常用的 UU 检测和分型方法,该法具有的优点是:高敏感性、高效率、高特异、高速度、简便。在 UU 检测中常用的用于基因扩增的序列有以下几种: 16SrRNA 序列、MBA 基因片断、16S223SrRNA 基因间隔序列及尿素酶基因等。利用 16SrRNA 序列上微小的差异可以将 UU 分为两大生物群。MBA 基因片断是最常用的扩增片段, Knox 等与 1998 年依据该基因 5! 末端序列的不同设计合成引物,在此基础上将 UU 的 biovar 1 分为 1、3、6型,利用随机片断多态性分析 DNA (RAPD)技术进行 UU 的biovar 2的亚群分析,并根据多态性条带将 UU 的
13、biovar 1 进一步分为13 个 RAPD 亚群。作者同时还运用巢式 PCR 扩增将biovar 2分为两个亚群,又运用 7 个引物进行随机片断多态性分析将UU 分为 13 个亚群,其中 biovar 2 分为 5 个亚群。XX 年Kong 等利用 biovar 1 中 1、3、6、14 标准株多条带抗原基因 5!末段之间的序列差异,结合使用群特异性 PCR 限制性酶切分析和血清型特异性 PCR 设计了实验方案,可以鉴别biovar 1中血清型 1、3 /14、6 型。Pitcher 等 15 采用PCR2 单链构象的多态性( PCR2SSCP)分析检测技术对 UU 标准菌株进行研究,仅需
14、一套简单的引物和单一的扩增步骤,成为大批量 UU菌株分型研究的有效方法。Yi 等 4 将 real2time PCR应用于临床 UU 基因分型的测定,发现 real2time PCR 法的灵敏度和特异度分别是 89. 5%和 98. 5% ,而培养法的灵敏度和特异度分别是 47. 4%和 100% ,从而认为 real2time PCR 法能快速有效地用于 UU 的基因分型研究。PCR 方法虽省时,但假阳性或假阴性均高,与操作者的水平密切相关。4. 3. 3 其他UU 检测和分型还有基因重组技术、反向斑点杂交技术等方法。5 解脲支原体基因分型与临床流行病学5. 1 解脲支原体基因分型与正常健康
15、人5. 1. 1 解脲支原体基因分型与正常体检人群在 Ren 16 的研究中,正常体检人群中 65%携带 UU,其中95%为 biovar 1, 5%为 biovar 2。基因型 1, 3, 6 和14 也可在正常人群中被检出,但单独分离出基因型 14 是少见的。这一发现与其它研究结果一致。5. 1. 2 解脲支原体基因分型与正常孕产妇及新生儿Echahidi 等 17 的研究表明,可以从部分健康新生儿的外阴、鼻咽部、支气管、眼、血液、胃液中分离到 UU,且外阴部的检出率高于其他部位,女婴的检出率高于男婴,携带时间长于男婴。Fernandez 等 8 对获取的新生儿标本进行 UU 培养和分型,
16、结果显示分离到的 UU 菌株 biovar 1 和 biovar 2 的比例为 70: 30。5. 2 解脲支原体基因分型与泌尿生殖系感染UU 不同的生物群及血清型与寄居和感染的关系是目前我国研究的一个热点。XX 年在朱庆义的研究中 384 例泌尿生殖系感染患者,临床分泌物标本 UU 阳性占 56. 8% ,采用10 对 MBA 基因分型引物对 UU 培养阳性标本进行 PCR 分型鉴定,结果检出 biovar 1 占 37. 2% , biovar 2 占 16. 9% ,其中biovar 1 血清型 1、3 /14 和 6 阳性率分别为 13. 0%、16. 7%和7. 5%; biovar
17、 2 亚型 1、2、3 阳性率分别为 6. 5%、7. 8%、2. 6%。XX 年在覃春容的研究中有阴道炎症状和体征的601 例患者组成的病例组,对照组 306 例为同期正常体检人群。病例组中 UU 阳性占 70. 0% , 其中单纯 UU 感染占57. 2%;单纯 UU 感染标本进行基因分型鉴定 , biovar 1 占65. 4% , biovar 2 占 18. 4% , biovar 1 + biovar 2 两群混合感染占 16. 2%;对照组 UU 阳性占 41. 2% ,其中单纯 UU 感染占32. 7% ,单纯 UU 感染基因分型 biovar 1 占 79. 3% , bio
18、var 2 占13. 8% , biovar 1 + biovar 2 两群混合感染占 6. 9%。结论是两组人群均以 b iovar 1 感染为主,病例组的特点是两群混合感染较对照组高,特别是 biovar 2 与 biovar 1 中 1 型的多型别感染较对照组高,在多型别感染中 1 型的检出率较对照组高。对照组的特点是 biovar 1 较病例组高,且以 biovar 1中的血清1, 3, 6 型的单纯感染为主; biovar 1 中 1 型的单型别感染较病例组高。3、6、14 型单型别感染在两组差异无显著性。5. 3 解脲支原体基因分型与性滥人群在 Ren 16 的研究中, 261 个
19、正常体检妇女和 98 个性工作者的宫颈拭子进行了培养, UU 培养阳性者用 PCR 法进行分群分型,数据表明: UU 在性工作者中比正常体检妇女更常见; biovar 1 中一种基因型的单纯感染( biovar 1基因型 1, 3或 6)在正常体检妇女比性工作者中更普遍; biovar 2 感染和 biovar 1 中超过一种基因型的混合感染在性工作者中更普遍; biovar 1 中基因型 1、3、6 在性工作者中及正常体检妇女中没有分布差别;尽管 biovar 2 的分离率在正常体检妇女高,但在性工作者中更高(90. 8% ) ,这意味着 biovar 2 在性工作者更常见且又是可能成为这个
20、人群的致病菌。性工作者中biovar 2 的分离率(26. 0% )大约是正常体检妇女biovar 2 的分离率(5. 0% )的 5 倍, biovar 1 多于一种基因型引起的混合感染率(23. 9% )比正常体检妇女(8. 6% )高 3 倍。综上所述,尽管人们为探讨不同血清型 UU 的致病性大量研究,但都无足以令人信服的证据说明某种血清型肯定和某种疾病有关,目前多数研究认为,人类泌尿生殖道寄居或感染的 UU 绝大部分为 biovar 1,其中某些类型与疾病有关,所以 UU 的分型对疾病的发病机制研究有重要的作用,是否特定型别 UU 与致病或寄居具有相关性仍是现在亟待解决的问题。目前的研究在结合治疗、耐药、预后方面仍有待进一步的研究。
