1、甲氨喋呤和雷公藤对类风湿关节炎滑膜细胞产生趋化因子的影响甲氨喋呤和雷公藤对类风湿关节炎滑膜细胞产生趋化因子的影响【摘要】 目的 探讨甲氨喋呤（MTX）和雷公藤多甙（TG）对类风湿关节炎（RA）滑膜细胞产生 CC 趋化因子受体 5 配体（CCL5）的影响。方法 分离于 11 例 RA 和 6 例骨关节炎（OA）的滑膜细胞行体外培养，并用细胞脂多糖（LPS）诱导 CCL5 产生，同时加入或不加入不同浓度的 MTX 或 TG。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清液中的 CCL5 水平。结果 RA 滑膜细胞体外自发产生 CCL5 水平高于 OA 滑膜细胞（P 0.05） ；LPS 刺激后，RA
2、 和 OA 滑膜细胞产生CCL5 水平均较刺激前显著升高（P 均 0.001） ，但二者间差异无显著性（P 0.05） ；MTX 和 TG 均可显著抑制 RA 滑膜细胞产生 CCL5，但二者抑制方式不同：MTX 剂量在 520ng/ml 的剂量范围内呈现剂量依赖性效应，之后随剂量的增大，其抑制作用不再进一步增强。而 TG 未显示出剂量依赖性抑制效应，仅在剂量达到或超过 60ng/ml 时出现比 MTX 更显著的抑制作用。进一步分析发现，TG 抑制 CCL5 产生与其所致的滑膜细胞死亡相关。结论 RA 滑膜细胞产生 CCL5 增高，MTX 和 TG 均可显著抑制 CCL5 的产生，其中 TG 抑
3、制 CCL5 产生与其细胞毒作用有关。【关键词】 关节炎 类风湿 趋化因子受体 5 配体 滑膜细胞The inhibitory effects of methotrexate and tripterygium glycosides on chemokine CCL5 production in synoviocytes from patients ith rheumatoid arthritis【Abstract】 Objective To determine the inhibitory effects of methotrexate and tripterygium glycosides
4、on chemokine CCL5 production in synoviocytes isolated from patients ith rheumatoid arthritis in the presence or absence of different dosage of MTX or TG. CCL5 level in cultural supernatants as measured by enzyme-linked immunosorbent assay .Results RA synoviocytes spontaneously produced higher level
5、of CCL5 than OA synoviocytes did. Both MTX and TG ere found to significantly inhibit LPS-induced CCL5 production in RA synoviocytes. Moreover， the inhibitory effect of MTX appeared to be in a dosage dependent manner in the concentration ranged from 0- 20ng/ml. Whereas TG shoed its inhibitory effect
6、only hen it reached at the concentration of 60ng/ml. Furthermore， the inhibitory effect of TG as found to be correlated ith TG-induced cell death.Conclusion The increased production of CCL5 by RA synoviocytes indicates a role of CCL5 in the pathogenesis of RA， and the disease modifying effects of MT
7、X and TG might be existed through their anti-CCL5 effect.【Key ords】 arthritis rheumatoid chemokines CC CCL5类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性炎性关节炎，其病理特征为大量炎性细胞在滑膜的浸润和在滑液的渗出，及由此导致的滑膜增生，血管翳形成，最终造成关节软骨破坏。近期的研究结果显示，趋化因子（chemokine）在 RA 的炎性细胞关节浸润中起着极为重要的作用1 。我们发现 RA 患者血清和滑液 CC 趋化因子受体5（CCR5）的配体 CCL5（RANTES）水平增高，并证实滑膜细胞是其产
8、生的主要部位，并且在用甲氨喋呤（MTX）和雷公藤多甙（TG）治疗后，CCL5 水平下降2，3 。为了进一步探讨 MTX 和 TG 在 RA 滑膜细胞产生 CCL5 的作用，我们通过体外滑膜细胞培养方法，观察MTX 和 TG 对 RA 滑膜细胞产生 CCL5 的影响。1 资料与方法1.1 一般资料 在本院就诊的、有膝关节积液的 RA 患者 11 例，男3 例，女 8 例，年龄 2168 岁，平均年龄 41 岁，病程 6 个月18年，平均 7.4 年。所有病人均符合美国风湿病学会 1987 年的 RA 诊断标准4 ，且近 1 个月内未用改变病情药物（DMARD）和甾体类激素。另选择有膝关节积液的
9、OA 患者 6 例作为对照组，其中男 2 例，女 4 例，年龄 4278 岁，平均年龄 49.3 岁，病程 2.612 年，平均 9.3 岁。1.2 滑膜细胞的分离与培养 实验采用滑液中的游离滑膜细胞进行培养。患者在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，在 4 1000 r/min 离心 10min，去上清后用无菌冷 PBS 10ml 悬浮细胞，经100 目尼龙网过滤去除凝块沉渣，细胞再用冷 PBS 洗 2 次后，悬浮于 DMEM 培养液（含 10%小牛血清，100U/ml 青霉素和 100g/ml 链霉素） ，混匀后取 10ml 行台盼蓝染色，活细胞计数。收集到的细胞接种于培养皿，置 CO2
10、 自动控制培养箱，于 37培养 12h 后，更换培养液去除非粘壁细胞，重复 23 次，至显微镜下观察绝大部分细胞呈梭状成纤维样细胞为止。用胰蛋白酶法收集滑膜细胞，按 105细胞/ml，每孔 0.5ml 复种于 24 孔培养板。1.3 滑膜细胞刺激 在预实验中发现，体外培养的滑膜细胞产生CCL5 浓度较低，不利于观察 MTX 和 TG 的作用，为此我们加用5g/ml 的细菌脂多糖（LPS）刺激滑膜细胞 CCL5 的产生，同时加入或不加入不同浓度的 MTX 或 TG，培养 48h，收集上清，置-30保存备用。1.4 CCL5 测定 采用酶联免疫吸附（ELISA）方法，CCL5 定量测定试剂盒（美国
11、 R D 公司生产）测定敏感度为 3.1pg/ml，操作按试剂盒说明书进行。1.5 统计学处理 两者间计数资料用 t 检验，CCL5 水平与药物浓度的相关性分析采用直线相关回归分析。2 结果 .1 RA 和 OA 滑膜细胞体外产生 CCL5 的检测结果 见图1。由图 1 可见，RA 滑膜细胞体外产生 CCL5 较 OA 滑膜细胞明显增高（P 0.05） 。用 LPS 刺激后，RA 和 OA 滑膜细胞产生 CCL5 均较未刺激的滑膜细胞显著增高（P 0.001） 。图 1 RA 和 OA 滑膜细胞体外产生 CCL5 的检测结果 2.2 MTX 和 TG对 RA 滑膜细胞产生 CCL5 的影响 见
12、图 2。由图 2 可见，MTX 和 TG 均可显著性抑制 LPS 诱导的 RA 滑膜细胞产生 CCL5。MTX 的抑制效果随剂量增大而增强，当浓度为 20ng/ml 时达最大效果，之后其剂量的增加并不能进一步抑制 CCL5 的产生。而 TG 并未显示出剂量依赖性抑制效应，仅当浓度达到或超过 60ng/ml 出现比 MTX 更显著的抑制作用。用台盼蓝染色法，对刺激后存活细胞计数发现，不同浓度的MTX 刺激后存活细胞数与单用 LPS 刺激并无差异。但用 TG 60ng/ml刺激后，当剂量达到 100ng/ml，几乎所有细胞均死亡。对 60ng/ml TG 刺激后 CCL5 水平与存活细胞数的相关性关系分析结果显示，CCL5 与存活细胞数呈显著性负相关（r=-0.781，P 0.05） 。
