1、 安徽医科大学硕士学位论文分类号： 密级：编号：U D C：学 位 论 文青春期双酚 A暴露对老年 CD-1小鼠背海马 Syt 1含量的影响Influence of Pubertal Exposure to Bisphenol A on Age-RelatedChanges of Synaptotagmin 1 in Dorsal Hippocampus of CD-1 Mice吴鹏超指导教师姓名申请学位级别提交论文时间陈贵海硕士安徽医科大学第一附属医院专业名称论文答辩日期神经病学2014-03 2014-05学位授予单位和时间 安徽医科大学答辩委员会主席 周江宁 教授评 阅 人 任惠民 教授
2、等安徽医科大学硕士学位论文2014年 5月安徽医科大学硕士学位论文论文题目 青春期双酚 A暴露对老年 CD-1 小鼠背海马Syt 1含量的影响Influence of Pubertal Exposure to Bisphenol A onAge-Related Changes of Synaptotagmin 1 in DorsalHippocampus of CD-1 Mice作者姓名 吴鹏超指导教师学科、专业研究方向陈贵海安徽医科大学第一附属医院神经病学脑衰老及其相关性疾病论文工作时间 2012年 2月至 2014年 03月安徽医科大学硕士学位论文2014年 5月学位论文独创性声明本人所呈
3、交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名： 日期：学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和
4、中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：日期：导师签名：日期：安徽医科大学硕士学位论文目录缩略语中英文对照表.1中文摘要.31.引言82.材料和方法.113.结果.164.讨论.225.结论.276.研究工作的进一步设想.27参考文献28附录33致谢34综述35安徽医科大学硕士学位论文缩略语中英文对照表缩写AD英文全称 中文全称Alzheimers diseaseBisphenol A阿尔茨海默病双酚BPACA C
5、ornu ammonis 海马角DABddH2ODG3,3-diaminobenzidineDi-distilled water3,3-二氨基 邻苯胺双蒸去离子水(海马)齿状回雌二醇dentate gymsE2 EstradiolEEDsFOADLPSenvironmental Endocrine Disruptorsfetal origins of adult diseaseliopolysacchande环境雌激素成人疾病胎源学说脂多糖LTDLTPlong-term depressionlong-term potentiation1arge dense core vesiclesN-met
6、hyl D-aspartateMorris water mazeoptical density长时程抑制效应长时程增强效应大致密核囊泡N-甲基 D- 天冬氨酸Morris水迷宫光密度值LDCVNMDAMWMODPBS Phosphate buffered salinesynaptotagmin磷酸盐缓冲液突触囊泡标记蛋白Syt1安徽医科大学硕士学位论文SV synaptic vesicles 小突触囊泡RAWMSAMPradial six-arm water maze 六臂辐射状水迷宫加速老化敏感小鼠senescence-accelerated prone mouseSNAP soluble
7、NSF attachment proteins 可溶性 NSF附着蛋白SNARE solublefusion protein attachment proteinreceptorN-ethylmaleimide-sensitive 可溶性 N-乙基马来酰胺敏感融合蛋白附着蛋白受体TH thyroid hormone 甲状腺激素2安徽医科大学硕士学位论文中文摘要青春期双酚 A暴露对老年 CD-1 小鼠背海马 Syt 1含量的影响背景随着我国老龄化人口逐年增多，衰老已经成为当今社会面临的一个难题。衰老伴随多种能力的改变，其中，衰老相关学习记忆能力减退已经成为研究热点。既往研究证实脑内海马特定区域神
8、经元突触蛋白含量的改变与学习记忆能力下降有关。海马是学习、记忆等高级神经活动的关键部位。研究提示海马依赖性学习记忆能力的改变与突触囊泡结合蛋白（Synaptotagmin 1，Syt 1）紧密相关。然而，目前有关 Syt 1在衰老过程中的含量改变的研究结果并不一致，而且在环境雌激素双酚 A（Bisphenol A, BPA）干预衰老模型中，有关海马组织 Syt 1含量改变的研究尚未见报道。目的探讨 CD-1小鼠背侧海马 Syt1蛋白含量的年龄相关性改变；探讨 CD-1小鼠青春期双酚 A暴露对老年期后（行为认知学上已出 现加速衰老）背海马 Syt 1蛋白含量表达的影响。方法 60只清洁级3周龄C
9、D-1小鼠购于安徽省动物中心，雌雄各半，普通 环境下分笼饲养。饲养环境为昼夜12h交替，温度控制在2025，湿度控制在50%60%。适应性喂养一周后，随机均分为对照组、低剂量BPA（1 mg/L ）组和高剂量BPA（100mg/L）组，每组20只。BPA购买于美国Sigma公司（货号239658，99.9%分析纯）。小鼠于出生后2956 天每天经自然饮水过程给予BPA（用1%酒精溶解），对照组给予等容量1% 酒精溶解于水中饮用。两个剂量组每天通过饮水平均摄入的 BPA量约为：高剂量雄鼠 24.630.6 mg/kg/day、高剂量雌鼠 23.329.0 mg/kg/day，低剂量3安徽医科大学
10、硕士学位论文雄鼠 0.230.30 mg/kg/day；低剂量雌鼠0.210.30 mg/kg/day。暴露后正常饲养。于17月龄进行行为学试验。另购5月龄CD-1小鼠18只，雌雄各半，作 为青年对照组，适应性饲养一月，与处理组小鼠同时进行行为学检测。以18月龄CD-1 小鼠为对象，以6月龄小鼠为青年对照，采用免疫组织化学技术检测背海马Syt 1含量（取平均光密度值作为蛋白的相对含量进入统计）。统计学分析涉及多因素方差分析、两独立样本t检验。结果Syt 1蛋白在所有参与实验 CD-1小鼠背海马 DG区、CA1区、CA3 区各亚层内均有表达；与6月龄 CD-1小鼠比较，18月龄小鼠背海马 DG门
11、区、颗粒细胞层、分子层，CA1区锥体细胞层、放射层，CA3区起层、锥体细胞层、分子层 Syt 1相对含量显著升高（P0.05）。结论在 CD-1 小鼠背侧海马各亚区，Syt1含量呈不同程度的年龄相关性增加；青春期双酚 A暴露的 CD-1鼠，其老年期背海马各亚层内 Syt1的相对含量升高，雌性小鼠更明显。关键词小鼠；学习记忆；海马；Synaptotagmin1；Bisphenol A4安徽医科大学硕士学位论文ABSTRACT Influence of Pubertal Exposure to Bisphenol A on Age-Related Changes of Synaptotagmin
12、1 in Dorsal Hippocampus of CD-1 Mice BackgroundWith Chinas aging population increased year by year, senility has become adifficult problem what todays society must face. Aging is accompanied with the changof various ability, among them, the age-related impairment of learning and memory hasbecome the
13、 hot spot of research. Previous studies have confirmed that the alteration ofthe synaptic protein content of neurons in certain areas of brain hippocampus wasassociated with the decline of learning and memory. Hippocampus is the key part ofhigher nervous activity, such as learning and memory. Resear
14、ches indicated that thechange of hippocampus dependent learning and memory was closely related to synapticvesicles binding protein (Synaptotagmin 1, Syt 1). However, currently, the results ofstudying the content change of Syt 1 in the process of aging were not consistent.Moreover, in the environment
15、al estrogen Bisphenol A (Bisphenol A, BPA) interventionmodel of aging, studies of the content change of Syt 1 in hippocampal tissues have notyet been reported.Objective To explore the age-related changes of Syt 1 in dorsal hippocampal of CD - 1mouse.To explore the contents of Syt 1 in dorsal hippoca
16、mpus of the CD-1 mice,which were repeated exposed to BPA during pubertal on them.MethodsThe 60 clean class 3-week-old CD-1 mice, half male and female, were housedseparately for 12h alternating day and night. Temperature controlled at 20 25,5安徽医科大学硕士学位论文humidity controlled at 50 % to 60 %. After a we
17、ek feeding adaptation, the mice wererandomly divided into control group, low-dose BPA (1mg / L) and high-dose BPA(100mg / L) group, n = 20. 29 to 56 days after birth by the natural process, miceexposed to BPA by drinking water every day (use a concentration of 1% alcoholsolution), control group were
18、 given the same amount of alcohol dissolved in water todrink. At 17 months of age to take the behavioral tests. There are 20 5-month-old CD-1mice, as a youth control group, adaptive feeding a month, take the behavioral tests withthe experimental group of mice. With 18 months of CD-1 mice as the rese
19、arch object,the 6 months of CD-1 mice for young control group. The syt 1 in dorsal hippocampuswere detected by immunohistochemistry (mean optical density was used as the relativecontent of the syt- 1 protein). Statistical analysis involving analysis of variance, twoindependent samples t-test a.Resul
20、ts Syt 1 were expressed in the layer of dorsal hippocampus DG, CA1 and CA3 areain all participants CD-1 mice in experiment.Compared to the 6-month-oldmice the relative content of Syt 1 was significantly higher than that in the DGHilusin, granular layer and stratum moleculare; and in CA1 stratum orie
21、ns,pyramidal layerstratun;and CA3 stratum lucidum,pyramidal layer and stratumoriens(Ps 0.05).Compared to the control group-mice ,the relative content ofSyt 1 was significantly higher than that in the in each stratun of dentate gyrushilus, stratum molecula, and CA3 pyramidale of the dorsal hippocampu
22、s in thehigh doses-group- mice (Ps 0.05). Compared to 18-month male mice, Thehight-dose BPA male mice had significantly highter level of syt 1 in CA3pyramidal layer of dorsal hippocampus (Ps 0.05) except the hilus of dentategyrus, CA1 stratum radiatum and CA3 stratum lucidum (Ps0.05). The syt 1leves
23、 in hight-dose BPA female mice had significantly highter than thatin18-month female mice in DG Hilusin, and stratum moleculare stratum and CA16安徽医科大学硕士学位论文stratum oriens(Ps0.05). Compared with elderly control group, there was nodifferences to low doses of BPA exposure of CD-mice of the content of Sy
24、t 1 indorsal hippocampal.SummaryThe content of age-related of Syt 1 were increased in different degree in eachsubfield of dorsal hippocampus.The CD-1 mice which exposured to BPA on pubertal,the contents of Syt 1 increased in each subfield of dorsal hippocampus especially for thefemale mice.Key words
25、：Hippocampus; Learning and memory; Mice; Synaptotagmin 1; Bisphenol A7安徽医科大学硕士学位论文青春期双酚 A暴露对老年 CD-1 小鼠背海马 Syt 1含量的影响1.引言随着社会经济的发展，人们的生活水平有了翻天覆地的变化，而近年来生育率持续保持较低水平，老龄化进程正在加快。 21世纪发达地区人口的那女平均寿命分别达到 71.1岁和 78.7岁，男女平均寿命最高的日本已经达到 76.8岁和 82.9岁。随之而来的老年性相关疾病日益成为社会面临的重要课题，而其中老年性痴呆人群带来的社会家庭负担尤为代表。阿尔茨海默病（Alzhe
26、imers disease，AD）是痴呆最多见类型，它是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以学习记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。对衰老造成的认知功能损害1的发生机理研究有助于进一步认识 AD等发生发展。学习记忆能力减退尤其是记忆能力减退是 AD最早期、最典型的临床症状之一。现今研究提示衰老过程中伴随学习记忆功能减退，但是导致这些记忆减退的机制依然不明确2。目前的假设之一是海马和新皮质突触蛋白水平改变可能与衰老相关性学习记忆能力减退有关3。背海马是学习记忆功能的关键区域，也是脑衰老敏感区，主要参与执
27、行空间记忆形成以及事件记忆处理。其年龄相关性活性改变可能是导致老年人或啮齿类动物记忆能力衰退的主要因素4-6 。老年大鼠在海马依赖性学习记忆任务（如放射状水迷宫7、Morris水迷 宫8,9）中有严重的认知损害。前期研究表明老年昆明小鼠和 SAMP8 小鼠在放射状水迷 宫和 Morris 水迷宫中有突出的学习记忆损害10,11 。但是，衰老海马并不存在神经元的减少，而其突触数量改变在老鼠或老年猴子海马亚区的表现也不是一致的 12,13 。研究认为衰老相关性记忆减退更多的是归因与突触功能的改变而非简单的神经元或突触数目的减少8安徽医科大学硕士学位论文14，更有可能是因为突触联络完整性遭到破坏。突
28、触联络完整性破坏学说也由此时逐渐形成15,16 。神经递质的释放能力改变可能是导致年龄相关性学习记忆能力减退的原因之一。既然海马特定区域改变与学习记忆关系明确，而衰老海马神经元数量并未减少，我们推断海马突触蛋白可塑性改变可能是导致衰老学习记忆减退的参与因素。有关衰老与突触蛋白关系的目前没有系统的研究，而且多集中在突触后蛋白2,6,9，而对于突触前蛋白的相关性研究较少。突触前机制主要涉及神经递质的释放过程，是神经递质正常顺利完成传递的第一步，是信息传递的基础。脑内多种活性物质（如 Ach 、NE、VP、ACTH等）被发现在信息 记忆储存中起着重要的作用，因此我们有理由相信递质的释放能力与学习记忆
29、密切相关。突触前蛋白以突触结合蛋白（Synaptotagmin，Syt）为代表，作为钙离子通道依赖的突触活性带蛋白，是目前为止被研究的最多的 syt家族成员之一17 。我们实验组前期研究8表明，SAMP8小鼠、C57BL/6 小鼠背海 马突触活性带蛋白 syt 1含量均随年龄增加而升高，且与学习记忆能力呈正相关，但机制未明。神经递质数量或质量的改变可能是年龄相关性学习记忆能力衰退的其中原因。所以继续探索衰老过程中海马突触蛋白 syt 1表达水平与学习记忆之间关系仍十分必要。神经递质释放的关键步骤是突触囊泡在突触活性带的锚定、预激、融合和膜的再循环。这些步骤都需要突触活性带蛋白（proteins
30、 of synaptic active zone，PSAZ）参与。Syt家族位于突触囊泡（主要是小清亮囊泡）表面，是调节融合的最关键的钙离子感受器之一。Syt 家族成员众多，目前在人类及鼠类共发现 15个，在脑组织中表达最多的亚型是 Syt 1，研究提示 Syt 1与学习记忆过程有关8。Syt 1的主要结构有一个小 N-末端、一个跨膜区以及两个胞质内的 C2区。C2 区又分为 C2A 、C2B两个区域，整个 C2区占 Syt 1胞质区的大部分 8。研究认为其中 C2A区是 Syt1钙离子和膜融合的主要结构域之一，调节神经递质的胞吐，其机制可能是 C2A结构域与钙离子结合后改变了细胞膜功能的临界
31、稳定性以及蛋白构象配体诱导的重新分布。Syt 1是重要的钙离子感受器，触发神经递质的释放以及调节 Ca 2+的同步融合：一方面通过 C2结构域与磷脂以依赖钙离子的方式直接促进突触囊泡膜和9安徽医科大学硕士学位论文质膜的融合，另一方面，其两个 C2结构域以依赖或不依赖 Ca 2+的方式结合可溶性N-乙基马来酰胺敏感融合蛋白附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide- sensitivefusion protein attachment protein receptor，SNARE 复合体)以抑制自发融合和促进同步融合9,10。据此，Syt 1影响 Ca2+胞内外流动，在突触
32、释放和传递递质过程中扮演关键角色，任何微小环节改变均可能引起递质释放能力的变化。我们课题组研究也进一步证明，SAMP8 小鼠、C57BL/6小鼠存在年 龄相关的学习记忆损害，并且与背海马 Syt 1含量表达呈正相关。已有研究表明多种突触前活性带蛋白如 complexin、syntaxin、synaptophysin 、rab 3a存在年龄相关性含量 变化，并且这种变化与学习记忆密切相关11,12 。为深入全面地了解突触活性带蛋白在衰老相关性学习记忆减退过程中所扮演的角色，本实验中选取突触前蛋白 Syt 1作为目标蛋白、CD-1小鼠为动物模型（前期试验证实 CD-1小鼠在海马依赖性学习记忆任务中
33、有严重的 认知损害），探讨背海马突触囊泡蛋白 Syt 1年龄相关性改变。正常随着年龄增加出现的衰老，即我们称之为的生理性衰老：是指成熟期后所出现的生理性退化,即人在体质方面的变化,也称正常衰老。但是总有不可避免的一些外来因素（如疾病、环境污染物、应激等）在生理性衰老的基础上加速衰老过程，我们称之为病理性衰老。随着外界环境日益复杂化，外来因素对人类生活质量的影响备受关注。20世纪九十年代提出的“成人疾病胎儿起源（Fetal origins ofadult disease， FOAD）”假说，以及近年来提出的 U-shap假说，给我们以启示：生命的早期阶段不良外界因素的干扰会给整个生命过程带来的持
34、续性的影响，有研究证明胚胎晚期母体暴露 LPS的 CD-1小鼠，中年期后出现严重的海马依赖性的学习记忆损害，且背海马相关脑区 Syt 1表达量呈正相关，加速衰老13 。双酚 A（Bisphenol A，BPA），与雌二醇化（Estradiol，E2）学结构相似，是目前最常见的环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors，EEDs）14,15之一，其化学结构与雌激素相似，并通过对 ER的 竞争性结合，及对雄激素活性的拮抗作用，在机体内发挥拟雌激素作用16。BPA是世界产量最大的一种有机化工原料，用于生产一次性塑料水瓶、食品罐内外涂层、牙科填充材料等方面，
35、与人10安徽医科大学硕士学位论文类接触极为密切。近年来，关于 BPA对健康的不利影响及其安全性已成为人民关注的热点话题。有研究表明 BPA具有生殖毒性、胚胎毒性，并呈浓度依赖关系17围生期 BPA暴露影响子代大鼠性行为和社会行为，发育中的脑组织对 BPA非常敏感，安全剂量的 BPA已可以影响脑和行为的发育18。高剂量 BPA（20 mg/kg/day）暴露发现对 C57BL小鼠学习记忆能力有显著损害15。在脑发育过程中，BPA 不仅影响脑内雌激素合成关键酶芳香化酶的表达和活性，还可改变不同脑区 ER 和ER的表达，并因此放大或干扰雌激素对脑发育的调节作用19。 BPA影响脑发育的细胞、脑区和时
36、间特异性，以及对脑发育过程影响的动态变化，使 BPA对脑发育的影响非常复杂。BPA对脑发育的影响主要归结于它的弱雌激素活性，干扰内源性雌激素对脑发育的调节作用。虽然国内外的研究者们对 BPA开展了大量的研究，但对脑发育影响的作用机制目前还尚未清晰，BPA对小鼠海马神经发生的影响也不清楚，对于 BPA造成的学习记忆损害机制更未明确。对于 BPA毒性的研究多集中在胚胎期、哺乳期，而对于青春期作为脑及其他器官组织发育的关键时期，BPA的毒性研究较少有报道。本实验将以 CD-1小鼠为研究对象，制造自然衰老模型和在青春期持续低剂量暴露 BPA的加速衰老模型，完成全套行为试验后取脑组织标本，制作普通组织蜡
37、快，采用免疫组织化学技术测定小鼠背海马各区各亚层内突触活性带蛋白 Syt 1含量变化情况，以研究不良因素暴露及衰老相关性学习记忆相关突触囊泡蛋白 Syt 1表达的影响机制。2.材料和方法2.1主要试剂和器材2.1.1一抗：抗 Syt 1多克隆抗体（美国 Sigma公司）2.1.2二抗：生物素标记羊抗兔 IgG S-P超敏试剂 盒（SP-9001，北京中杉金桥生物科技有限公司分装，美国 ZYMED公司）。2.1.3 DAB显色试剂盒（ARl022，武汉博士德生物工程有限公司）2.1.4 PBS缓冲液（ pH 7.27.4）11安徽医科大学硕士学位论文2.1.5 0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液
38、(CB，pH 6.0，1000 m1)2.1.6双蒸去离子水（ddH2O）2.1.7 4%多聚甲醛2.1.8二甲苯2.1.9乙醇（无水乙醇，98%乙醇，75%乙醇）2.1.10 0.3 %过碘酸2.1.11盐酸酒精2.1.12苏木素2.1.13中性树胶（上海凯博生物有限公司）2.1.14石蜡包埋仪（BM-型，安徽电子科学研究所）2.1.15生物组织自动脱水机（8T12K，湖北省孝感亚光医用电子技术研究所）2.1.16石蜡切片机（LEICA RM 2135型，上海莱卡仪器有限公司）2.1.17切片漂烘温控仪（QPB2，安徽省电子科学研究所）2.1.18微波炉（上海中达医药应用研究所）2.1.19
39、 4 C冰箱（澳柯玛 ）2.1.2020 C冰箱（美菱）2.1.2180 C超低温冰箱（中科美菱）2.1.22 37 C水浴箱（上海医 疗器械厂）2.1.23烘箱（O/BKYY10-1996上海跃进医疗器械厂）2.1.24纯水机（HB-RO/05，杭州惠邦净水设备有限公司）2.1.25加样枪（2.5 l、10 l 、100 l、200 l、1000 l）和枪头2.1.26精密 pH计（PHS-3C，上海雷磁仪器厂）2.1.27电子天平（上海天平仪器厂）2.1.28光学显微镜（Olympus，日本）2.1.29图像分析系统（Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics
40、公司，美国）2.1.30 BPA (美国 Sigma 公司)2.2实验动物12安徽医科大学硕士学位论文60只雌雄各半的 CD-1小鼠购自安徽省医学实验动 物中心（3周龄，清洁级）。雄鼠单笼饲养，雌鼠每 3-4只一笼饲养。常规条件喂养，自由进食、进水。老鼠房温度：20 25；湿度 505；每日早七点开灯、晚上七点关灯；定期更 换垫料、消毒老鼠房。适应性喂养一周后（4月龄）的 CD-1 小鼠被随机分为 3组：对照组、BPA高剂量组(100mg/L)、BPA低剂量组(1mg/L)，每组 20只，雌雄个 10只。各组均用统一规格饮水瓶，BPA溶解于 1%酒精，然后配成上述两组浓度，供小鼠自由饮用，对照
41、组正常饮用蒸馏水；每日定时清洗饮水瓶，更换溶液，防止BPA浓度变化。BPA组暴露时间为小鼠生长第 4周-第 8周，8周后与对照组正常进食、进水。该批小鼠饲养至 17月龄时，从安徽医科大学实验动物中心引进健康清洁级 5月龄 CD-1小鼠 20只（雌雄各半），饲养方式同上述 对照组，作为青年对照组。1月后筛除各组中脱毛、肿块、运动障碍的小鼠，剩余小鼠进入行为学测试。2.3标本制备脑标本制作：完成筑巢、囤积、平衡木及放射状水迷宫等行为学测试后两周，将健康无疾病 CD-1小鼠引颈脱臼处死，低温环境下快速取出 脑组织，做好标记后放置于 4 % 的多聚甲醛溶液中固定 12小时，流水冲洗 4小时后进行石蜡包
42、埋，-20C冷冻蜡块后连续冠状切片，片厚 4.0 m，置于防脱玻片，控水后置于 60烤箱烤片 2 h，标本制备完成后保存于 4冰箱中。最终进入免疫组织化学法试验的标本有 57个：BPA高剂量组 13个（雄性 8个、雌性 5个）、BPA低剂量组 15个（雄性 8个、雌性 7个）、老年空白对照组 13个（雄性 7个、雌性 6个）、青年对照组 16个（雄性 8个、雌性 8个）。2.4免疫组织化学染色步骤2.4.1普通组织切片脱蜡和水化：90的温箱内烤片20分钟，二甲苯脱蜡2次，每次5分钟，由高到低浓度的梯度酒精泡洗3次，每次2分钟， PBS冲洗3次，每次5分钟。2.4.2灭活内源性过氧化物酶：避免内
43、源性过氧化物酶和显色剂反应而产生非特13安徽医科大学硕士学位论文异性着色。快速向每个脑组织滴适量0.3%过碘酸，覆盖整个脑组织，室温下孵育1 min，双蒸水冲洗5 min 3次。2.4.3组织抗原热修复：组织中的抗原在多聚甲醛的固定及蜡块的制作过程中，蛋白之间会发生交联、醛基封闭，而导致抗原性消失。经过抗原修复，细胞内抗原决定簇得以重新暴露，从而使得抗原检测率提高。本研究采用微波修复法，将切片浸入装有抗原修复液（即柠檬酸盐缓冲液）的容器中，并置于抗原修复微波炉中修复20 min，然后自然冷却至室温，如果突然降温会导致打开的蛋白结构再次交叠，既而影响修复效果。冷却后PBS冲洗5 min 2次，应
44、注意抗原修复后至显色前必须浸在PBS中以避免干片，因 PBS能保持抗原活性，故而 实验要一直在湿盒中进行。2.4.4血清封闭：组织切片上存在多种抗原成分，有些位点能够非特异性的和一抗结合，从而导致结果的假阳性；封闭血清不能和一抗来源一致，以避免其能与二抗结合反应造成实验干扰。本研究中采用BSA方法进行封闭。每个脑组织加1滴BSA，放置于37 C温箱中10 min。倾去多余的封闭液，避免稀释一抗，无需冲洗。 2.4.5 37水浴锅复温 40分钟，PBS 冲洗3次，每次 5分钟。除去PBS液，每张切片滴加适量生物素标记山羊抗兔/小鼠IgG工作液，37下孵育20分钟。PBS 冲洗 3次，每次5 分钟
45、。2.4.5一抗孵育：每个脑组织滴加适量的Syt1多克隆抗体（抗体稀释度为1:800 ）（抗体稀释度为1: 600），放置在湿盒中置于4C冰箱内过夜（使抗体与暴露的抗原充分接触）。2.4.6复温：将放置切片组织的湿盒从4C冰箱取出，放置于 37C温箱内复温40min，然后PBS冲洗 5 min 3次，最后一次冲洗结束后尽量擦干组织周围多余的PBS，以减少其 对二抗的稀释，同时注意避免干片。2.4.7二抗孵育：向每个脑组织滴加适量二抗并覆盖脑组织，置于37C温箱内孵育20 min，然后PBS冲洗 5 min 3次，最后一次冲洗结束后尽量擦干组织周围多余的PBS，以减少其 对下一步的稀释作用。2.
46、4.8 SABC（链酶亲和素 过氧化物酶复合物）：加 SABC液，置于37 C水浴14安徽医科大学硕士学位论文箱内孵育20 min，PBS冲洗 5 min 4次2.4.9 DAB显色（配制：1ml蒸馏水中加显色剂，B，C各一滴混匀，避光使用）：DAB是过氧化酶的底物，在其作用下可生成棕黄色产物。经预实验探索，设定 Syt1显色时间4分钟，（光镜下掌控显色程度及时间，一般到特异性染色较深但本底着色较淡时为佳），使用双蒸水立即终止显色反应。由于DAB有致癌作用，显色结束以后流水冲洗15min。24.10烤干封片：为了切片的长期保存，使用中性树胶封片。首先将玻片放置于铁质玻片架上，放入90 C烤箱2
47、0min，烤干水分后，在载玻片组织上滴加适量二甲苯稀释过的中性树胶，利用二甲苯的透明作用，使染色更加清晰。用盖玻片从一角开始缓慢放置，直至接触到树胶液体，应注意避免产生气泡。2.4.11阴性对照为 PBS代替一抗（ Syt 1）；阳性对照为已知 Syt 1染色结果的切片2.5免疫组织化学染色切片照相及图像分析首先于普通光学显微镜下选择染色成功并且海马完整的切片，然后将选好的切片置于 1020 倍 显微镜下，调整照相条件，注意关闭自动白平衡，并记录设置条件，以便在以后多批次照相时保持同一条件，减少误差。在镜下分别对海马齿状回（DG：门区、颗粒细胞层、分子层）、CA1区（起层、锥体细胞层、放射层、
48、分子层）和 CA3区（起层、锥体细胞层、透明层、分子 层）观察、照相，图像以 TIFF格式保存，应用图像分析软件 Image Pro Plus 6. 0进行分析。亚区各层的 Syt 1相对含量用免疫反应产物光密度值（optical density，OD）代表。由于标本选取的形状大小有异，故以平均 OD值（累积 OD与选取面积的比值）作为 Syt 1相对水平进入统计学分析。2.6统计学处理统计软件：SPSS 13.0。实验数据通过检验符合正态分布，采用均数标准差表（ x S）示。采用方差分析检验检测 ：1.BPA 组和老年对照组 CD-1小鼠 Syt 1相对表达量的差异；2.老年对照组与青年对照
49、组 CD-1 小鼠背海马各区各亚层 Syt 115安徽医科大学硕士学位论文相对表达量的差异；检验水准设定为 P = 0.05。3.结果3.1正常衰老 CD-1小鼠背侧海马 Syt 1的相对含量设置背景颜色为无色；设置用 BPS染色脑组织为阴性对照；设置既往 Syt 1蛋白特异性染色为阳性对照。阴性对照脑组织未见特异性染色，与背景色颜色接近一致；阳性对照着色呈有一定分布特点的不均匀棕褐色至棕黄色斑块状结构。在光学显微镜200背下观察年 6月龄和 18月龄 CD-1 小鼠背海马区结构。Syt在各组小鼠的背海 马的 DG区的门区、颗粒细胞层、分子层和 CA1的起层、锥体细胞层、放射层、分子层，CA3的起层、颗粒细 胞层、放射层、分子层均可见棕褐色板块结构，见图(1)。正态检验发现所有数据呈正态分布，6月龄的青年对照组与 18月龄的老年对照组的年龄效应比较采用两独立样本
