1、 安徽医科大学硕士学位论文安徽医科大学硕士学位论文安徽医科大学Anhui Medical University硕士学位论文论文题目载脂蛋白E在胰腺癌中的表达及其临床意义Expression and clinical significance of apolipoprotein E in pancreatic ductal adenocarcinoma作者姓名指导导师学科、专业研究方向论文工作时间陈龙江陈炯教授外科学（普外）胰腺癌分子标志物2012年 4月至 2014年 3月2014年 05月安徽医科大学硕士学位论文安徽医科大学硕士学位论文目录英文缩略词对照表中文摘要英文摘要正文引言材料与方法结
2、果讨论结论问题与展望参考文献附录致谢综述与参考文献1235581621262727323435安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词对照表Abbreviation英文缩写PDACNC英文全称 中文全称pancreatic ductal adenocarcinomaNormal contrals胰腺导管细胞癌正常对照组ApoE Apolipoprotein E 载脂蛋白ECA19-9CEACarbohydrate Antigen 19-9Carcinoembryonic antigenCarbohydrate Antigen 125Carbohydrate Antigen 242Fluorescen
3、ce 2-D Difference GelElectrophoresis糖链抗原19-9癌胚抗原CA125CA2422D-DIGE糖链抗原125糖链抗原 242双向荧光差异凝胶电泳MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption/ ionizationtime of flight mass spectrometry基质辅助激光解析电离飞行时间质谱ROCCTReceiver operating characteristic curvesComputed tomography受试者操作曲线计算机体层摄影术核磁共振成像MRI Magnetic resonan
4、ce imagingPosition emission tomographyHeat-shock protein-27PET 正电子发射体层摄影热休克蛋白-27HSP27MMP-9DEPCSDSMatrix metalloproteinase-9Diethyl pyrocarbonate间质金属蛋白酶-9二乙基焦磷酰胺十二烧基硫酸钠四甲基乙二胺Sodium lauryl sulfateTEMEDTrisTetramethylethylenediamineTris(hydroxymethyl)aminomethaneOptical density difference三羟甲基氨基甲烷吸光度差OD
5、1安徽医科大学硕士学位论文载脂蛋白E在胰腺癌中的表达及其临床意义研究摘 要目的本课题组 前期的蛋白质组学研究发现载脂蛋白 E（ApoE）在胰腺癌患者血清中的表达水平显著升高。本研究旨在进一步探讨 ApoE在胰腺癌中的表达情况及其临床意义。方法收集安徽医科大学附属省立医院普外科 2010年 6月至 2012年 7月经病理证实的胰腺癌及正常胰腺组织标本各 10例，同时另调取胰腺癌蜡块 45例、正常胰腺组织蜡块 10例，40例胰腺癌患者及年龄、性别匹配的健康对照个体血清。采用 Real-time PCR、Western blot及免疫组化方法，分别从转录和翻译水平比较 ApoE在不同胰腺组织中表达水
6、平的高低。同时，我们采用 ELISA方法分别检测 40例胰腺癌患者及对照者血清中 ApoE及 CA19-9的水平，并评估其临床诊断价值。结果 Real-time PCR结果显示 ApoE 的 mRNA 在胰腺癌组织中的相对表达量显著高于其在正常胰腺组中的相对表达量，两组中 ApoE mRNA 的平均相对表达量分别为 4.48（2.418,13.239），1（0.343,3.042）；而 Western blot结果同样显示胰腺癌组中 ApoE 的表达量显著高于正常胰腺组；免疫组化结果表明 ApoE主要表达部位为胞浆，其在胰腺癌组织及正常胰腺组织当中的阳性表达率分别为 78.2%、15%。而进一
7、步的对免疫组化表达情况、患者的临床病历资料统计分析结果则提示 ApoE的表达率与胰腺癌 T分级及 TNM分期密切相关，即 T分级和 TNM分期越晚的患者，其肿瘤组织中 ApoE的表达水平越高。最后，ELISA结果显示 ApoE的表达水平在胰腺癌患者血清当中的表达亦升高，ROC曲线分析显示 ApoE在鉴别胰腺癌患者与健康对照者时，其曲线下面积、敏感性及特异性分别为 0.79、76.2%、71.4%；CA19-9在鉴别胰腺癌患者与健康对照者时，其曲线 下面积、敏感性及特异性分别为 0.83、66.7%、85.7% ；如联合 ApoE和 CA19-9则曲线下面积、敏感性及特异性分别可达到 0.89、
8、76.2%、90.5%。结论 ApoE在胰腺癌中的高表达具有普遍性。作为胰腺癌相关分子标志物，单独2安徽医科大学硕士学位论文检测其表达水平或与其他肿瘤标志物联合检测，或将有利于胰腺癌的诊断及病情评估。关键词 胰腺癌 载脂蛋白-E分子标志物蛋白质组学3安徽医科大学硕士学位论文Expression and clinical significance of apolipoprotein E in pancreatic ductal adenocarcinoma AbstractPurpose Our previous proteomic studies revealed that apoliprot
9、ein E (ApoE) wereelevated in the sera of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Tofurther confirm the results and investigate the correlation between the ApoE and PDAC,we employed the present study.Methods We collected 10 cases pathologically proven PDAC tissue and 10 cases normalpan
10、creatic tissues; meanwhile, 55 paraffin-embedded tissue blocks (45 PDAC tissuesand 10 normal pancreatic tissues) were obtained from the Pathological Department forimmunohistochemical analysis. In addition, serum samples were obtained from 40patients with histologically confirmed PDAC and 40 age- and
11、 sex- matched normalcontrols. Real time PCR, western blot and immunohistochemistry were employed tocompare the expression of ApoE in these tissue samples. Then, we also analysis therelationship between the ApoE expression and various clinicopathologic parametersaccording to the immunohistochemistry
12、results. Finally, ELISA methods were used tomeasure the levels of ApoE and CA19-9 in the sera from 40 PDAC patients and 40 age-and sex-matched normal individuals. The sensitivity and specificity of ApoE andCA19-9 in distinguishing PDAC from normal individuals were evaluated by receiveroperating char
13、acteristic curves (ROC) method.Results The expression of ApoE were significantly different among the PDAC tissues,normal cancer adjacent tissues and chronic pancreatitis tissues. High level of ApoE wasdetected in PDAC tissues from transcript and protein levels. Furthermore,immunohistochemistry resul
14、ts indicated that the overexpression of ApoE positivelycorrelated with advanced T status and TNM stages. The ELISA results revealed that4安徽医科大学硕士学位论文serum ApoE and CA19-9 were higher in PDAC group than in normal control group(median level, 40.7ug/mL vs. 55.1ug/mL, P=0.003 for ApoE; median level, 18.
15、4U/mLvs. 152.2U/mL, P=0.001 for CA19-9). According to the ROC curves analysis, thesensitivity and specificity for distinguishing PDAC from NC were 76.2 and 71.4 %,respectively, for ApoE, 66.7 and 85.7 %, respectively, for CA19-9, and 76.2 and 90.5%,respectively, for their combination.Conclusions The
16、se results suggest that the elevation of ApoE levels may be animportant characteristics of PDAC. ApoE is possible a PDAC-related biomarker. Italone or in combination with other markers will provide additional information for thediagnosis and clinical administration of PDAC.Key words Pancreatic ducta
17、l adenocarcinoma/Apoliprotein E/Biomarker/Proteomics5安徽医科大学硕士学位论文载脂蛋白E在胰腺癌中的表达及其临床意义研究1.引言胰腺癌是常见的消化道肿瘤之一，其恶性程度极高，给人类的生命健康带来严重威胁，且近年来其发病率有明显增加的趋势。在美国，2013年胰腺癌新发病例约 45,220人，其中男性 22,740人，女性 22,480人；同年胰腺癌死亡 38,460人，同发病人数大致相持平，成为第 4位肿瘤致死原因1。在我国，全面的胰腺癌流行病学调查资料尚缺乏，1998-2007年肿瘤登记地区统计资料显示，合计粗发病率约为 6.48/10万，且
18、发病率呈现出城市高于农村、男性高于女性的 规律。十年间，城市男性和女性粗发病率每年分别以 1.86%、2.1%的速度上升，而农村该项指标分别为 7.54% 、7.83%。据此估计，至 2015年，该地区新发胰腺癌病例将达到 103,428例，位居恶性肿瘤死亡的第 6或 7位2。胰腺癌的病因及发病机制尚未明确，目前认为可导致胰腺癌发生的高危因素包括肥胖、吸烟、新发 2型糖尿病、慢性胰腺炎及长期的消化不良症状等。由于胰腺的解剖位置隐蔽（位于腹膜后）、起病隐匿、无明显早期症状、恶性程度高、极易出现侵袭转移，从而导致胰腺癌患者的早期诊断极其困难、根治性手术切除率低、预后极差。尽管现代外科技术、肿瘤放化
19、疗及生物靶向治疗领域取得了长足的进步和发展，胰十二指肠切除术围手术期死亡率也已经降至 5%以下，但 30年胰腺癌患者的远期生存率并未发生明显的改善。约 75的患者在确诊后 1年内死亡，总体 5年生存率不超过 6%3。现阶段，改善胰腺癌恶劣预后的唯一可行性措施是寻找到更加行之有效的方法用于胰腺癌的诊断，从而提高其早期诊断率。有研究表明约 85的患者在确诊时即发生了局部或远处的侵犯、转移，而超过半数的晚期肿瘤病人虽然经过有效治疗，但最终都死于侵袭与转移；而无胰腺外侵润及淋巴转移的早期胰腺癌其根治性切除后可获得良好效果，5年生存期可高达 75%4。因此提高胰腺癌的早期诊断率及控制其侵袭与转移是目前控
20、制胰腺癌的关键，也是肿瘤研究领域的热点。目前胰腺癌的诊断主要依赖于医学影像学技术检查，如 B超、CT、MRI及 PET-CT，所提供的信息，6安徽医科大学硕士学位论文同时参考相关血清肿瘤标志物等实验室检测指标。但是由于影像学检查受设备和医师专业技术水平影响很大，难以用于缺乏特异性症状人群的筛查。除此之外，影像学检查对于肝脏、腹腔隐匿性转移灶及血管的侵犯常常被遗漏。从而导致部分病例在术中才发现肿瘤不能切除，一定程度上对患者造成较大的创伤，影响了他们选择最佳的治疗方案。因此，临床工作者尤其希望能够寻找到具有较高敏感性和特异性的胰腺癌肿瘤标志物服务于临床，为胰腺癌的早期诊断、病情评估和预后判提供新的
21、可靠指标，为胰腺癌发生发展机制的阐明提供理论和实验依据，最终改变其恶劣的预后和提高患者的远期存活率。目前常用的胰腺癌肿瘤标志物包括 CA19-9、CA125、CEA等，尤其 CA19-9是首选的肿瘤标志物。Goonetilleke等5对 22篇较 高水平的文献进行荟萃分析，发现 CAl9-9用于诊断胰腺癌的敏感性和特异性分别为 79(7090)、82(68 91)，显示出其较高的应用价值。当其同 CAl25、CEA、CA242 等联合检测时，敏感性和特异性将更高；当同影像学检查联合应用往往能够为影像学检查疑似胰腺癌而又难以确诊的病例提供有用的信息 6,7 。目前临床观察结果提示CAl9-9的表
22、达水平同肿瘤分期呈正相关，瘤体越大、分期越晚，则该胰腺癌患者血清中 CAl9-9呈高表达水平的可能性就越大。Hartwing等8的研究表明术前血清CAl9-9水平在一定程度上能评估胰腺癌侵袭转移情况。确诊的胰腺癌病例中，未发生严重侵袭转移而获得手术根治性切除率同患者术前 CAl9-9表达水平似乎呈负相关关系。该研究通过比较对比分析 CAl9-9水平正常与 CAl9-9水平升高患者，发现手术可切除性由 80持续降至 40；而获得 R0切除的概率则由 53降至28%。但是必须引起注意的是，临床上应用 CA19-9时存在着一定的局限性： 早期胰腺癌患者体内的 CA19-9水平常无明显升高，而出 现明
23、显升高时肿瘤往往已处于中晚期；在良性胆道梗阻、慢性胰腺炎、急性肝炎及部分胃肠道疾病患者当中，CA19-9的表达水平也会呈现出不同程度的升高； 普通人群中约占 1015左右的个体因 Lewis抗原阴性而自始至终无 CAl9-9的表达，对于这一部分患者，即使胰腺癌已进展至晚期，其体内亦不能检测到高表达的 CA19-9 9。因此，临床上需通过与其他肿瘤标志物联合应用或与影像学检查联合应用才能提高胰腺7安徽医科大学硕士学位论文癌的诊断率。近年来，随着蛋白质组学技术的蓬勃发展并成功应用于肿瘤领域，越来越多的胰腺癌相关蛋白被发现并呈现出较高的应用价值。 El-Mesallamy等10对比分析了 23个胰腺
24、癌病人，32个糖尿病人和 20个健康对照的血清，最终发现视黄醇结合蛋白-4 (RBP-4)、中性粒细胞明胶酶相关 载脂蛋白（NGAL）、胰岛素样生长因子 1（IGF-1）以及胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）在胰腺癌患者血清中差异表达十分明显；且胰腺癌患者术后血清蛋白 RBP-4和 NGAL的表达水平较术前显著下降。ROC曲线分析显示临床使用价值最高的是 NGAL,其敏感性及特异性分别达到 75%及 87%，几乎可以同 CA19-9 相媲美。Wang等11利用 2-DIGE和 LC-MS证 明了多种蛋白在胰腺癌 组织中呈现差异表达，首次报道了纽蛋白（vinculin）在胰腺癌组织中
25、表达升高，其在胰腺癌细胞粘附、转移中可能起着重要作用。Poruk12等最近通过分析比较 86个胰腺癌患者、86个正常对照个体及 48例慢性胰腺炎患者血清发现骨桥蛋白（ OPN）在胰腺癌患者血清中的表达水平 显著升高，差异有统计学意义。即通过测定血清中的骨桥蛋白水平，能够较好的区分胰腺癌、慢性胰腺炎及健康对照个体。除此之外，该研究进一步的随访资料还提示，在胰腺癌患者当中，血清当中骨桥蛋白水平越高的患者，其总体的远期生存率越低。其他报道较多的蛋白还有热休克蛋白-27（HSP27）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等 13,14。本课题组在前期的筛选胰腺癌分子标志物的研究工作中，通过采用经典的蛋白质
26、组学技术-差异凝胶电泳（2D-DIGE ）联合基质辅 助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对比分析胰腺癌患者、胰腺良性 肿瘤患者、慢性胰腺炎患者及健康对照者血清当中蛋白质成分及表达量的差异，筛选并初步鉴定出在胰腺癌患者血清当中存在差异表达的大量蛋白点，如载脂蛋白 E（Apo E）、转甲状腺素蛋白（TTR）、胎球蛋白（AHSG）、补体 C3、补体 C4b1、结合珠蛋白(HP)、TNIP2蛋白和血清淀粉样蛋白 P 15。在蛋白质组学实验中，这些蛋白点均呈现 2倍以上的差异表达。经仔细查阅国内外文献报道，我们发现近年来，有关脂类代谢同肿瘤的研究常见报道 16-18 。脂类不但是
27、所有细胞膜及细胞器膜的重要组成结构，而且能够为细胞提供能量供给，能够为快速生长的肿瘤细胞提供所需的结构8安徽医科大学硕士学位论文物质及供能物质。而 ApoE是参与脂类代谢过程中的一个重要的分子，它除了通过与低密度脂蛋白（LDL ）受体、极低密度脂蛋白（VLDL）受体相结合而参与脂类的代谢和胆固醇的转运的功能之外，ApoE还在包括免疫应答、抗氧化、组织修复及细胞增殖和分化等诸多领域发挥着重要作用。高表达的 ApoE与胰腺癌相关性这一现象也多次被观察到。二者之间可能存在着密切的相互关系，但具体机制目前尚不明确，值得进一步深入的探索，故 ApoE在胰腺癌中的表达情况及其临床意义引起了我们极大的兴趣；
28、同时为了再次验证本课题组的前期蛋白质组学研究结果并初步探讨 ApoE在胰腺癌当中的作用，我们进行了此项研究，并报道如下。2.材料与方法2.1标本收集 2010年 6月至 2012年 7月间于安徽医科大学附属省立医院胆胰外科行手术治疗患者的新鲜组织标本，所有标本均经病理证实，其中胰腺癌组织、正常胰腺组织各 10例，所有标本均在术后 30分钟内采集，液氮速冻后转入-80C低温冰箱保存备用。由于完全正常的胰腺组织难以收集，故正常胰腺组织来源于因胰腺创伤、胰腺良性疾病（胰腺假性囊肿、良性腺瘤及慢性胰腺炎等）而行胰腺手术患者，且取材距病变 1cm以上。此外，55例福尔马林固定-石蜡包埋的胰腺组织由本院病
29、理科调取，其中胰腺癌 45例，正常胰腺组织 10例。最后，我们还收集了胰腺癌患者外周血 40例、年龄及性别相匹配的健康体检者外周血 40例用于 Elisa检测，离心（4000gx10min,4C ），提取上清并置于-80C 低温冰箱保存。所有患者术前均未进行放、化疗，所有血标本均于入院后第二天采集。该项研究得到安徽医科大学附属省立医院伦理委员会的批准，已做到患者的知情同意。2.2病例纳入标准（1）胰腺癌组纳入标准：均为初诊患者，术前未 进行过任何化疗或放疗等干预性治疗；均行手 术切除治 疗； 经过病理诊断 证实；住院资料及随访资料完整；除外其他 恶性肿瘤。（2）正常胰腺对照组织纳入标准：均为初
30、诊患者， 术前未进行过任何化疗或放9安徽医科大学硕士学位论文疗等干预性治疗；术前 经影像学检查，临床诊断排除胰腺 恶性肿瘤； 需行手术术治疗，术后病理诊断证实为胰岛细胞瘤、囊腺瘤、导管内粘液性肿瘤、胰腺假性囊肿、慢性胰腺炎及胰腺外伤；住院资料及随 访资料完整； 排除恶性肿瘤。（3）健康对照组纳入标准：基本资料完善（如姓名、性 别、年龄、既往病史等）；既往无明显 器质性疾病史（如 肿瘤、糖尿病、冠心病、肝病等）； 血尿常规、肝肾功能、腹盆腔 B超、胸片、心电图等常规体检项目无明显异常。2.2主要试剂Trizol Reagent逆转录试剂盒氯仿美国invitrogen 公司Fermentas公司上
31、海建信化工有限公司试剂厂上海苏燃化学试剂有限公司南京化学试剂厂无水乙醇异丙醇DEPC Ruibio公司引物及探针合成荧光定量试剂及实验耗材RIPA细胞裂解液SDS美国invitrogen 公司TaKaRa公司碧云天生物技术研究所德国serva公司BCA蛋白质定量 试剂盒甘氨酸碧云天生物技术研究所美国AMRESCO公司美国sigma公司Tris碱TEMED 美国sigma公司硫酸氨、丙烯酰胺PVDF膜过美国sigma公司美国millipore 公司上海中试化工总公司美国AMRESCO公司美国Fluka公司甲醇甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺光谱彩虹预染蛋白Marker 北京康为世纪生物有限公司10安徽医科
32、大学硕士学位论文ECL超敏发光试剂盒一抗美国Pierce 公司美国Santacruz公司二抗 北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京康为世纪生物科技有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司上海源叶生物科技有限公司乙醇、二甲苯山羊血清封闭液链霉卵白素DAB显色剂ELISA试剂盒2.3主要仪器普通PCR仪 美国ABI公司DYY-6B型稳压稳流电泳仪TGL-18R冷冻 离心机荧光定量PCR仪低速离心机北京六一仪器厂黑马仪器公司美国ABI公司上海飞鸽离心机TDL-40BEppendorf可调 式移液器科大创新股份有限公司中佳分公司意大利 SCOTSMAN上
33、海复旦生物实验技术研究所北京市六一仪器厂可调式移液器高速离心机AF-10 型自动制冰机FR-180A型电泳槽DYY-11型电泳仪LDZ4型微量离心机Modulus多功能光度 计TGL-20M高速台式冷 冻离心机ZD-9556水平 摇床纯水机北京医用离心机厂美国Turner BioSystems长沙湘仪离心机仪器有限公司太仓市科教器材厂美国 SIM垂直板电泳槽 北京市六一仪器厂电热恒温鼓风干燥箱电子天平上海一恒科学仪器有限公司美国METTLER TOLEDO11安徽医科大学硕士学位论文微量移液器压片盒德国 Eppendorf广东粤华医疗器械厂有限公司德国Hereaus公司切片机微波炉 上海医疗器
34、机械厂日本SANYO恒温箱显微镜CX-40Stat Fax 2100酶标仪2.4常用溶液的配制日本Olympus公司美国AWARENESS公司（1）磷酸盐缓冲液(PBS)：取PBS粉(购自北京中杉金 桥生物技术有限公司)1包，充分溶解于高压灭菌超纯水中，超纯水定容至1000ml，过滤、分装，置于4恒温冰箱储存备用；（2）柠檬酸盐缓冲液(抗原修复液)：取柠檬酸盐粉(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)1 包，充分溶解于高压灭菌超纯水中，超纯水定容至1000ml，过滤、分装，置于4恒温冰箱 储存备用；（3）10% 十二烷基硫酸钠溶液（10%SDS）：取10g 固体SDS 置于100ml蒸馏水中，50
35、水浴助溶滴入盐酸调节 溶液pH至7.2，分装，室温保存；（4）10过硫酸胺（10%AP）：称取0.1g过硫酸铵，加入1ml超纯水，充分溶解，于4 保存可使用2周左右；（5）30(w/v) 丙烯酰胺溶液：分别称取29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水充分溶解，定容至100ml，调整溶液pH值低于 7.0，分装于棕色瓶中室温贮存；（6）5Tris-Glycine电泳缓冲液：分别称取15.1g Tris粉末、94g甘氨酸和5.0g SDS，加入适量去离子水中充分，定容至1000ml,室温保存。(7) SDS-PAGE凝胶配制：浓缩胶和分离胶的配方分别如下（碧云天SDS-PAGE 凝胶配制试剂
36、盒）：12安徽医科大学硕士学位论文浓缩胶（2ml） 10%分离胶（5ml） 15%分离胶（5ml）双蒸水 1.4 ml330 ul250 ul20 ul20 ul2 ul1.9 ml1.7 ml1.1 ml2.5 ul1.3 ml50 ul30%丙 烯酰胺混合液1.0mol Tris(PH6.8)10% SDS1.7 ml50 ul10% AP 50 ul2 ul50 ul2 ulTEMED2.5.实验方法2.5.1.Real-time PCR检测（1）称取新鲜胰腺组织 50-100mg，组织剪剪碎，加入 1ml的 Trizol，使用组织匀浆器置于冰上进行充分的匀浆；（2）吸取裂解液于 EP管
37、中，离心（10000g*10min，4），充分去除尚未完全裂解的组织；（3）取出 EP管，加入 0.2ml氯仿，盖紧离心管，剧烈振荡约 15秒，并于室温下放置 3min；（4）离心（10000g*15min，4），取上层水相约 500ul，加入到一新的 EP管中；（5）加入 0.5ml异丙醇，温和混匀，室温放置 10分钟；（6）离心（12000g*10min，4），弃去上清；（7）加入 1ml 75乙醇（DEPC水配制）进行洗涤，涡旋混匀，离心（7500g*5min，4），弃上清；（8）沉淀的 RNA放置室温下自然干燥 5-10min；（9）加入 20lDEPC水溶解 RNA沉淀，用枪头反复吸
38、取混匀， 55水浴促溶 10min，进行下游实验或-80保存 备用；（10）取 0.2ml EP管，加入 8ul总 RNA、10M Oligo（dT）1 l、3ul DEPC水，小心混匀、离心机点动混匀；（11）将 EP管置于 PCR仪上，加热 70 *5min，立即冰浴 3min。13安徽医科大学硕士学位论文（12）取出 EP管并加入 5Reaction Buffer 4.0ul、10mM dNTP Mix 2ul、Ribolock TMRnase inhibitor 1ul、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 1ul；（13）混匀，加热 42*
39、60min ，70 *5min；（14）取出上述反应液，即为 cDNA，进行下游实验或-80 保存备用；（15）取 2ul上述反应液作为荧光定量的模板，反 应体系如下：10ul 的 2qPCRTaqman mixture、0.4ul的 10uM正向引物、0.4ul的 10uM反向引物、0.4ul的 10uM探针、2ul的模板 DNA，各管定容至 20ul；（16）充分混匀，置于荧光定量 PCR仪中，进行扩增，反应参数设置如下：预变性 95C、 10 min，变性 95C、30s,退火 57C、30s ，延伸 72C、30s，最终延伸72C，10 min，进行 44个循 环；（17）其中内参人
40、-actin上游引物序列：5-CAACTTCATCCACGTTCACC-3，下游引物序列： 5-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3，产物大小 71bp；ApoE上游引物序列： 5 -CTGCGTTGCTGGTCA-3 下游引物序列： 5-GCTCCTCGGTGCTCT-3，产物大小 244bp。2.5.2. Western blot实验（1）称取 50mg左右的组织标本，剪碎，利用液氮、研 钵充分研磨组织，加入 500ul的 RIPA细胞裂解液（含浓度为 1uM的 PMSF ）进行裂解。利用 Polytron进一步匀浆（17,000转/分*1分钟，4），冰上孵育 30min；（2）离
41、心（12,000 g，5min），收集上清液，组织总蛋白提取完毕；（3）取上述蛋白样品溶液，按 1:4的体积比例加入 5*SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在沸水浴中加热 5分钟，完全使蛋白发生变性；（4）待样品冷却至室温后，将蛋白质样品溶液直接上样至凝胶加样孔内即可，每孔加入 10ul样品，进行电泳。电泳参数设置如下： 浓缩胶使用电压 80v，时间 30分钟；分离胶使用电压 120v，时间 1小时。当条带迁移至胶最底部约 1cm的距离时，停止电泳；（5）将滤纸和 PVDF膜裁至同胶条相同大小(PVDF膜要求预先放入甲醇中浸泡 3分钟，有利于蛋白质结合到 PVDF膜上），然后浸入转膜缓冲液中 3
42、分钟；14安徽医科大学硕士学位论文（6）按顺序放置好转膜装置，从下到上放置的先后顺序依次为：阳极板、三层滤纸、PVDF膜、凝胶、三层滤纸、阴极板，注意确保滤纸、凝胶、PVDF膜的精确对齐，并需要注意仔细去除各层间的气泡。接通电源，恒定电流完成转膜，所用的转膜条件为：ApoE的蛋白分子量为 34kDa，转膜电流为 120mA，时间为 1h；（7）转膜完毕后，取出 PVDF蛋白膜并置于预先已准备好的 Western blot洗涤液内，漂洗 3分钟，充分洗去膜上的残留的转膜液，过程中注意蛋白膜的保湿；（8）加入 5%的脱脂奶粉，封闭亚硝酸纤维膜上没有结合样品蛋白的地方结合上蛋白，置于水平摇床上缓慢摇
43、动，室温封闭约 2小时；（9）微型台式真空泵吸尽封闭液，然后依据一抗的说明书，按照合适的比例用一抗稀释液对一抗进行稀释，具体如下：（抗 -actin抗体，抗体属性为鼠抗；1:1000稀释，10% 的分离胶）；（抗 ApoE抗体，抗体属性为兔抗；1:1000稀释，10%的分离胶），室温条件下孵育 2h，加入 Western洗涤液进行洗涤，共洗涤 3次，每次洗涤 5分钟；（10）依据二抗的说明书，按照 1:10000的比例用二抗稀 释液稀释由辣根过氧化物酶标记的二抗（-actin二抗 为山羊抗鼠，ApoE的二抗为山羊抗兔），室温条件下孵育 1.5小时，加入 Western洗涤液进行洗涤，共洗涤 3
44、次，每次洗涤 5分钟。若结果背景较深则适当延长洗涤时间及增加洗涤次数；（11）于暗室中将膜置于暗盒中，在膜上加一保鲜膜，加入 ECL试剂后，剪一胶片盖在膜上，关闭暗盒，曝光、显影、定影，观察结果。2.5.3.免疫组化实验（1）蜡块于切片机常规切片，厚 3mm；(2)充分脱蜡，将组织切片分别置于二甲苯中 10分钟、更换二甲苯 10分钟、无水乙醇 5分钟、95%乙醇 5分钟、70%乙醇 5分钟，PBS溶液洗 3次3 min；（3）切片置于封闭通透液内浸润 30分钟，PBS溶液洗 3次3 min；（4）预先于微波炉内加热 0.01M的 PBS溶液至沸腾，将切片放入，关闭电源，间隔 5分钟，重复 2次
45、，PBS溶液洗 3次 3 min；（5）滤纸充分吸干切片周围水分，用组免疫化笔于组织周围划上圆圈，于圆圈内15安徽医科大学硕士学位论文组织滴加山羊血清工作液（即试剂 A），放入湿盒中，室温条件下孵育 15分钟，倾去，勿洗；（6）取出切片，轻轻甩去片上血清，并用滤纸擦干残留血清，滴加预先适当比例稀释的一抗，37孵育 3小 时；（7）去除一抗，PBS冲洗 3min3次，滤纸擦净片上残留液体，直接滴加已适当稀释的二抗（即试剂 B），37条件下孵育 15分钟 ；（8）PBS 冲洗 3min3次，滤纸擦干片上残留液体，滴加辣根酶标记链酶卵白素（即试剂 C ），37 恒温烤箱内孵育 15分钟；（9）取出，
46、PBS冲洗 3min 3次，直接滴加 DAB显色剂适量，室温条件下显色时间约为 5分钟（3-10分钟），由显微镜下观察颜色变化控制时间，见颜色变化即可终止反应；（10）PBS 冲洗 3min3次，双蒸水冲洗 5分钟，滴加一大滴苏木素染液，数秒后自来水冲洗干净，双蒸水冲洗 5分钟，PBS返蓝 5分钟；（11）将片子分别置于不同浓度乙醇中进行脱水处理：50%乙醇 1- 2分钟、70%乙醇 1- 2 分钟、95% 乙醇 1- 2分钟、95% 乙醇 1- 2分 钟、100%乙醇 1- 2分钟、100%乙醇 1- 2分钟；（12）透明、封片；（13）观察结果：实验中阴性对照则采用 PBS替代一抗。实验结
47、果由我院病理科两位高年资主治医师单独阅片，并采用半定量法判断实验结果：其中阳性细胞的比例（低于 1%，0分；1-9%，1分；10-49% ，2分；高于 50%，3分），染色的强度为（未着色，0分；淡黄色，1分；黄色，2分；棕黄色，3分），每例片子均以阳性细胞所占比例乘以染色强度表示最终结果，最终得分高于 3分即可认为属于阳性表达。2.5.4.ELISA实验（1）包被抗原：用 0.05M pH9的碳酸盐包被缓冲液将特异性抗体稀释至蛋白质最适浓度 110g/mL，在每一聚苯乙烯板的反应孔内加入 0.1mL，4过夜；（2）洗涤：次日，弃去反应孔内溶液，用洗涤缓冲液（含 0.05%吐温-20）洗 3次
48、，16安徽医科大学硕士学位论文每次 3分钟；（3）加样：加预先已同稀释缓冲液稀释的待检样品 0.1mL入上述已包被之反应孔中，置 37孵育 1小时；（4）洗涤：弃去反应孔内溶液，用洗涤缓冲液（含 0.05%吐温-20）洗 3次，每次3分钟；（5）加酶标抗体：将预先稀释的新鲜酶标抗体 0.1mL加入于各反应孔中，37条件下孵育 0.51h；（6）洗涤：弃去反应孔内溶液，用洗涤缓冲液（含 0.05%吐温-20）洗 3次，每次3分钟；（7）加底物液显色：各反应孔中滴加新鲜配制的 TMB底物溶液 0.1ml，37条件下孵育 1030min，另作一空白对照组（0.2ml底物加 0.1ml终止剂）；（8）终止反应：于各反应孔中加入 2M硫酸 0.05mL ；2.6.统计学处理所有数据均采用专业统计软件 SPSS19.0进行分析，定量资料以均数标准差表示，定性资料以例
