1、宿主细胞DNA损伤反应与重组腺相关病毒载体基因表达 交稿日期：2013-12-14彭俊纯，刁勇，李招发，王启钊， 第一作者：彭俊纯（1990-），女，硕士研究生，研究方向：肝纤维化基因治疗. E-mail:jmpjc0622吕颖慧 通信作者：刁勇（1967-），男，教授，博士，主要从事基因治疗研究; E-mail: diaoyong,.联系电话：0595-22690516.（华侨大学生物医学学院 泉州 362021） 基金项目：国家自然科学基金资助项目(81371669, 81271691,81201183); 国家国际科技合作项目（2011DFG33320）； 福建省自然科学基金资助项目(2
2、012J01397)摘要：重组腺相关病毒（Recombinant AAV，rAAV）载体因其宿主范围广、免疫原性低等优点，被公认为是基因治疗的最有前景的治疗载体之一。但体内基因表达效率太低是限制rAAV载体临床应用的关键问题之一，如何提高rAAV载体的表达效率是本领域研究的热点。近期研究发现，宿主细胞内DNA修复机制对rAAV载体的核内行为有重要影响。本文主要阐述rAAV载体与DNA修复机制的关系，并讨论通过操纵DNA修复提高rAAV载体表达及基因打靶效率的方法。关键字：腺相关病毒； 基因治疗； DNA损伤修复；基因打靶中图分类号：Q78Interplay between DNA-damage
3、 response and recombinant adeno-associated virus vector in host cells PENG Jun-chun，DIAO Yong，LI Zhao-fa，WANG Qi-zhao，LV Ying-hui(School of Biomedical Sciences. Huaqiao University. Quanzhou 362021, China )Abstract：Recombinant adeno-associated virus (Recombinant AAV, rAAV) vectors is recognized as on
4、e of the most promising therapy vectors for gene therapy because of its wide host range and low immunogenicity. However, its low transduction efficiency in vivo limits its clinical application. How to improve its transduction efficiency is one hotspot for rAAV research. Recent studies indicated DNA
5、repair machinery in the host cell maybe play important roles on rAAV transduction process. In this paper, we focused on the interactions between rAAV vector genomes and DNA repair machinery, and how to improve rAAV transduction and gene targeting based on the malpulation of DNA repair machinery. Key
6、 words： Adeno-associated virus; Gene therapy; DNA damage repair; Gene targeting基于腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）构建的重组腺相关病毒（rAAV）载体，因免疫源性低、致病风险小、宿主范围广，而成为目前基因治疗研究的热点。以rAAV为载体的基因药物Glybera于2012年正式在欧盟获准上市，表明rAAV基因药物的临床有效性和安全性已获得认可1。在rAAV载体中，野生AAV的病毒基因Rep和Cap被目的基因表达框所替代，保留的病毒成分仅仅是基因组两端 145bp长度的反向末端重复（I
7、nverted terminal repeats, ITR）序列。rAAV载体因不能在宿主细胞内表达AAV蛋白，无法有效地复制其基因组，导致转基因表达效率较低。增加rAAV载体用量可以提高其转基因表达水平，但人体应用后有可能诱发宿主免疫反应等毒副反应2-4。如何提高rAAV载体的基因表达效率，是其走向临床广泛应用的关键。rAAV载体转导细胞的过程包括多个步骤（图1），包括与靶细胞表面受体的结合、受体介导的病毒内吞、内体介导胞质内运输、从内体逃逸后入核、核内脱壳释放基因组、双链形成、转录和翻译等，其中每一步骤都可能影响rAAV载体的表达效率。rAAV载体的基因表达，需要宿主细胞内相关机制的积极参
8、与。近期的研究表明，宿主细胞的DNA修复机制对rAAV的核内行为，包括基因组的双链化、环化以及染色体整合等，具有重要影响。而rAAV载体转基因的转录与翻译，均在细胞核内发生。因此，本文就细胞DNA修复机制与rAAV载体的相互关系进行讨论，并探讨通过调节宿主细胞DNA修复机制，提高rAAV载体基因表达的可能性。图1 rAAV载体的细胞内命运Fig.1 Fate of rAAV vector in cells1 DNA损伤反应与rAAV核内过程rAAV载体作为入侵者进入宿主细胞后，首先会遭遇宿主细胞天然免疫反应的围剿5。rAAV载体基因组进入细胞核后，还会受到核内DNA修复机制的围剿。细胞核内DN
9、A修复是真核细胞与生俱来的，实施病毒防御的机制之一。实际上，DNA修复机制是细胞为了确保体内遗传信息的正确性，在进化过程中形成的针对所有原因导致的DNA损害的修复补救措施。当rAAV在细胞核内脱壳后，其释放的基因组DNA游离末端，会立刻激活DNA修复系统，其命运被宿主细胞所主宰。所以，rAAV在细胞内基因表达水平的高低，是其与DNA 修复系统博弈的最终结果。早期研究表明，DNA 修复系统对rAAV基因组的核内过程具有重要影响。当细胞遭遇基因毒性应激时，包括UV照射和抗癌药物处理， rAAV载体的转导效率会显著增加6, 7。与分裂细胞比较，非分裂细胞的转导效率促进作用更加明显。因这些应激往往造成
10、细胞DNA损伤，而DNA损伤又会激活DNA修复途径，人们推测DNA修复途径的激活可能促进了rAAV的表达活性。之后大量有关DNA修复与rAAV表达之间相互关系的深入研究，使人们对其中的分子机制有了初步认识。1.1 rAAV 载体DNA的双链化因rAAV基因组内只有两端ITR是病毒序列，不能表达其它任何病毒基因产物，rAAV基因组的加工几乎完全依赖宿主细胞。rAAV载体在进入细胞核后，脱壳释放出单链基因组DNA。单链DNA两个游离末端的大量存在，立刻激活细胞DNA修复系统，随后单链基因组DNA被转换成为各种形式的双链DNA8, 9。有证据表明，在rAAV入核后，细胞内Mre11/Rad50/NB
11、S1 (MRN)复合物被激活，并与rAAV载体的ITR结合，抑制rAAV的转导10, 11。已知MRN复合物是DNA同源重组修复(homologous recombination repair, HRR)机制中重要成分12。HRR是利用姐妹染色单体、或同源染色体、或DNA重复序列的重新组合，对DSB损伤进行修复的机制，多发生于细胞周期的S/G2期。MRN的功能主要是检测双链DNA断裂 (double-strand break，DSB ) 损伤，并利用Mre11内切和外切核酸酶活性处理DNA断裂末端，以形成可重组的3 单链尾巴13。HRR机制中另外一个成分，共济失调-毛细血管扩张突变基因（ata
12、xia-telangiectasia mutated，ATM ），也可能参与rAAV基因组双链转化。因为在ATM缺陷的细胞，单链rAAV的转导效率显著提高14。然而，最近Cataldi等提出ATM并不参与rAAV基因组的第二链合成15。因为在ATM缺陷的细胞，基因组是双链的自身互补型rAAV（self-complementary rAAV， scrAAV）载体的转导效率也可以增强。因此，ATM对rAAV的转导抑制，也可能是基于基因沉默机制。 另一个可以抑制rAAV基因组双链转化过程的因子是酪氨酸磷酸化FKBP52 ，其与ITR结合并抑制第二链的合成16。T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶（TC- PTP）
13、将FKBP52去磷酸化后，FKBP52释放ITR，允许rAAV基因组以ITR为引物自身合成双链17。催化rAAV基因组DNA第二链合成的DNA聚合酶是DNA聚合酶18 ，这是一种在DNA修复过程中，可弥补DNA单链缺口的聚合酶19。1.2 rAAV 载体DNA的环化在宿主细胞内，DNA修复机制不仅介导rAAV基因组的双链转换，还会通过分子内或分子间DNA重组，将其加工成为单分子环状附加体及多分子环状附加体等形式。这些双链环状附加体的存在，对于rAAV的长期基因表达非常重要，因为它们可以在非分裂细胞内，以染色质的形式稳定存在20。在rAAV基因组的环化重组过程中， ITR元件发挥了举足轻重的作用
14、。T形发夹结构的ITR触发DNA损伤反应，宿主细胞迅速募集一系列的DNA修复蛋白参与rAAV基因组的环化重组，其中包括HRR机制涉及的ATM、MRN和Bloom蛋白(BLM)，还包括非同源末端连接(non-homologous end-joining , NHEJ )机制涉及的DNA蛋白依赖激酶催化亚基（DNA-PKcs）、Artemis和 Warner 蛋白（WRN）15, 21, 22。rAAV基因组的分子内环化重组主要依赖于NHEJ途径，重组DNA接头处存在不同程度的核苷酸缺失，与NHEJ介导的分子重组机制一致22。NHEJ途径不需要两段DNA间具有严格的同源性，只是借助相关蛋白将两段D
15、NA末端链接起来，在整个细胞周期都可以进行。DNA-PKcs和Artemis是NHEJ途径DSB修复的两个主要成分。Artemis由DNA-PKcs激活后，具有核酸内切酶的活性，可促使ITR发夹中的环和护翼结构解离，以促进双链DNA末端连接23。在没有DNA - PKcs或Artemis时，培养细胞和动物组织rAAV内分子内重组会显著降低15, 22, 24。值得注意的是， NHEJ途径可能与rAAV基因组的表观遗传修饰相关联15。通过NHEJ途径进行的rAAV基因组环化重组，产生的环化基因组表达活性高。HRR可能是rAAV分子间环化重组的主要途径，因在缺乏NHEJ途径关键因子DNA - PK
16、cs或Artemis时，分子间重组也可有效地发生22。对重组分子交界处的序列进行研究，发现存在长度为165 nt的双D 序列ITR结构，这正是HRR的特点25。来自同一血清型AAV的同源ITR之间的重组，优于不同血清型AAV异源ITR之间的重组26，也表明这一猜测的正确性。在DNA PKcs功能缺陷的SCID小鼠组织中，呈现HRR特点的rAAV重组比例增加，这表明在动物非分裂细胞中，在不存在DNA - PKcs蛋白的情况下，HRR会代偿性激活。 BLM和WRN均属于RecQ家族的DNA解旋酶成员，分别是HRR和NHEJ途径的关键因子。其主要作用均是松驰双链DNA，以确保重组中间体的形成27。
17、1.3 rAAV 载体基因组的整合野生型AAV可以依赖Rep蛋白，与宿主细胞染色体发生定点整合，如定点整合于人19号染色体19q13.42的AAVS1位点28。但rAAV不表达Rep蛋白，因此，它缺乏定点整合到细胞基因组的能力，发生随机整合的频率一般为rAAV转导总量的0.129。 当宿主细胞基因组存在DSB 损伤时，rAAV基因组可以被细胞基因组断裂位点捕获，由DNA修复机制介导发生整合30。动物实验也表明，rAAV基因组的随机整合可能会引起插入突变，导致小鼠发生肝细胞癌31。对培养细胞和小鼠组织中发生rAAV整合的基因序列进行分析，发现rAAV的整合不会以利落的剪裁和粘贴方式发生，总是伴随
18、着不同程度的序列缺失32-35，甚至会导致染色体易位。这些研究提示，是NHEJ机制介导了rAAV整合的发生。DNA-PKcs对于rAAV整合具有明显的影响，但不同的研究却报告了截然相反的结果。在体外无细胞rAAV整合系统，加入DNA-PKcs蛋白抑制rAAV的整合，加入DNA-PKcs抗体则促进rAAV的整合36；在DNA-PKcs缺陷的SCID小鼠， rAAV的整合频率显著高于正常小鼠36，提示DNA-PKcs抑制rAAV整合。但当使用高表达DNA-PKcs的M059K细胞及DNA- PKcs缺陷的M059J细胞进行研究时，发现DNA-PKcs蛋白可以促进 rAAV的整合15, 37。也有可
19、能是其它因子（如ATM），共同参与了rAAV的整合过程14, 15，每种因子的作用大小取决于细胞和rAAV类型。总之，在DNA修复机制如何介导rAAV整合方面，尚未有明晰的结论。2 DNA损伤修复与rAAV基因表达rAAV载体转导非分裂细胞的效率远远优于分裂细胞。随着细胞分裂的进程，以染色体外附加体形式存在的rAAV基因组会逐渐在子代细胞中稀释，而失去基因表达活性。而在非分裂细胞中，rAAV基因组可以稳定存在，并维持长期表达活性20，所以提高rAAV载体转导非分裂细胞的效率，成为实现长期、高效表达转基因的关键。Alexander等最早发现，以紫外光照射等方式对非分裂细胞进行DNA损伤处理，可提
20、高rAAV载体的转导效率达750倍6。随后Russell等7报道，用阿非迪霉素或羟基脲等DNA合成抑制剂预处理正常人成纤维细胞，rAAV载体转导效率可提高300倍以上。拓扑异构酶抑制剂依托泊苷或喜树碱也有同样的效果。近期研究表明，羟基脲等药物可以干扰细胞DNA损伤应答元件的功能38。核仁素（nucleolin ，NCL）和核基质蛋白（nucleophosmin ，NPM）是参与DNA损伤反应的因子，具有结合单链DNA和RNA的能力39, 40。羟基脲可能是通过减弱这些因子结合rAAV基因组的能力，从而提高rAAV载体的转导效率38。这些结果提示，合用具有激活细胞DNA损伤修复能力的药物，是提高
21、rAAV载体人体内基因表达效率的可行手段。目前可以应用的药物，有顺铂、羟基脲、喜树碱、或鬼臼乙叉甙等10。3 DNA损伤修复与rAAV基因打靶基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中特定基因功能的方法，是矫正致病基因的有效方法。普通基因治疗载体介导的基因打靶效率，一般低于细胞总数的百万分之一，而rAAV的效率却高达141-44。如果通过位点特异性内切核酸酶，在靶基因位点引入DSB，更可以将重组效率进一步增加60-100倍以上45, 46。 有关rAAV介导的基因打靶分子机制研究刚刚开始起步。起初认为rAAV载体的单链性质是进行高效基因打靶的关键47。最近发现基因组为双链的rscAAV介
22、导基因打靶的效率，与单链 rAAV不相上下48。rAAV载体的基因打靶主要发生在S期细胞，在已分化的细胞则效率很低49, 50，说明rAAV基因打靶应用的DNA修复途径，与基因组整合不同。总的来说， NHEJ似乎是rAAV整合的主要途径，而rAAV基因打靶则使用HRR途径51。Rahman52等最近发现，rAAV基因打靶效率也可以通过合用小分子药物而提高。靛玉红-3-肟是一种治疗白血病的有效药物，属于细胞周期激酶（CDK）抑制剂。肿瘤细胞经靛玉红-3-肟处理后，细胞周期停滞发生在细胞周期的G1或G2期，此时以rAAV基因打靶，效率可以提高6倍。4 小结尽管rAAV基因药物的临床应用已经获得认可
23、，大量临床研究也正在顺利进行中，但人们对rAAV在宿主细胞内的行为还知之甚少。从病毒学、分子生物学等角度，认真研究rAAV载体的基本生物学性质，尤其是其胞内命运的分子机制，一定会有利于其临床应用潜力的挖掘。DNA损伤修复对rAAV载体的胞内命运，是非常有意义的研究方向，相关成果的取得也一定会为rAAV转基因表达和基因打靶效率的优化奠定扎实的理论基础。参考文献（References）1 Miller N. Glybera and the future of gene therapy in the European UnionJ. Nat Rev Drug Discov. 2012, 11(5):
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