1、 分类号密级： 密级UDC明胶与多酚的相互作用研究硕士学位论文明胶与多酚的相互作用研究作 者 姓 名： 刘晓晓西 学科、专业： 食品科学华大学硕士学位论文学 号： 212011083201019指 导 教 师： 陈祥贵完 成 日 期： 2014.04Classified Index:UDC:Xihua UniversityMaster Degree DissertationStudy on the Interaction of Gelatin and PolyphenolsCandidate : Liu Xiaoxiao Major : Food Science Student ID: 212
2、011083201019 Supervisor: Prof. Chen Xianggui April, 2014西华大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文作者签名：日期：指导教师签名：日期西华大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，
3、在校攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。(保密的论文在解密后遵守此规定)学位论文作者签名：日期：指导教师签名：日期西华大学硕士学位论文摘 要植物多酚含有多个酚羟基，在茶叶、水果、蔬菜、谷物等植物中含量丰富。随着人们健康饮食意识的加强，因多酚的多种营养保健功能和药理活性，研究者们越来越重视它的利用。越来越多的研究是如何从植物中提取、纯化多酚，以及如何去除果蔬汁中的多酚，以提高其稳定性，对多酚的
4、综合利用的报道很少。本论文对明胶与多酚的相互作用进行了研究，旨在为植物多酚的综合利用奠定技术基础。选取表食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、安石榴苷、原花青素、 绿原酸 4种多酚为代表，研究明胶浓度、反应时间、多糖添加量对明胶 -多酚络合反应的影响。采用乳化-交联 法制备明胶微球，以微球/多酚质量比、时间 、温度为影响因子，初步探讨明胶微球对多酚的吸附性能。以 EGCG为例，高温水浴法解吸被微球吸附的多酚，并 实现明胶微球的重复利用。主要研究结果如下：1. 明胶溶液与多酚的络合试验表明：当多酚浓度为 0.88mg/mL，反应体积比为 1:1时，明胶溶液的浓度须在 0.2-20mg/mL范围内才能
5、与多酚发生反应，形成沉淀。其中明胶溶液与 EGCG、安石榴苷、原花青素反应的现象 较明显。2. 通过分别添加不同量的蔗糖、果胶、黄原胶，研究其对明胶 /多酚络合的影响，结果表明随着多糖含量的增加，其对溶液反应的影响增强。3. 明胶微球的制备：精密量取 30mL液体石蜡于 250mL锥形瓶中，加入 450L0.05g/mL 司盘 80，搅拌。水浴加热至 5560 ，加入 10mL 0.05g/mL明胶溶液，60下乳化 10min。乳化结束后，冰浴，使温度降至 10以下，加入 50L 50%戊二醛，撤去冰浴，固化 2h。用丙酮洗 34次后，将制得的微球浸于 10mL丙酮中，4下放置一段时间，滤去丙
6、酮，晾干，即得。4. 明胶微球对多酚的吸附试验中，反应体系pH为3.5 ，吸附时间为120min ，最佳吸附温度为3545 。当质量比为 1:1时，单位明胶微球吸附的多酚量最大。当 质量比为1:5时，明胶微球对EGCG的吸附率为54.86%，明胶微球对安石榴苷的吸附率为78.01%，明胶微球对原花青素的吸附率为54.94%，明胶微球对绿原酸的吸附率为7.42%。5. 以EGCG为例，采用高温水浴法解吸附被微球吸附的多酚，当多酚微球 质量比为1:0.5时，微球可达到100%解吸附。对明胶微球进 行10次重复利用，可实现8次有效利用。第四次利用时吸附率最高达72.6%，解吸率最高达62.5%。关键
7、词：多酚；明胶；络合；猝灭；吸附；解吸；重复利用I明胶与多酚的相互作用研究AbstractThere are a lot of phenolic hydroxyl groups in plant polyphenols which are rich in tea,vegetables，fruits, grains and other plants.With people paying more and more attention on theawareness of healthy diet,more studies on polyphenols are being done. Much m
8、ore research ison how to extract and purify polyphenols from plants and how to remove polyphenols fromfruit or vegetable juice to improve its stability. There is few reports about the utilization ofpolyphenols. In this paper, the interaction of gelatin and polyphenols is studied aiming atutilization
9、 of plant polyphenols technical foundation.Complex reactions respectly among gelatin and kinds of polyphenol likeepigallocatechin gallate (EGCG), punicalagins, proanthocyanidins, polyphenols chlorogenicacid are studied with the factors of gelatin concentration, reaction time, polysaccharidesamount.
10、Gelatin microspheres are prepared with the method of emulsion and cross-linking.Adsorption properties of gelatin microspheres for polyphenols are preliminarily studied withthe factors of mass ratio of microspheres/polyphenol, the time, the temperature. Take EGCGfor example, the polyphenols adsorbed
11、by microspheres are desorped by the method ofhigh-temperature water bath, and gelatin microspheres are reused for 10 times. There aresome main results as following:1. In the complex tests between gelatin and polyphenols, it showed that, as theconcentration of polyphenol is 0.88mg/mL and volume ratio
12、 was 1:1, the complex didntoccur to form precipitate until the concentration of gelatin solution was 0.2-20mg/mL. Thereactions of complex were obvious among gelatin/EGCG, gelatin/punicalagins and gelatin/proanthocyanidin.2. It showed that, with the adding of sugar, pectin, xanthan gum respectly,poly
13、saccharides impact on the complexation reaction was enhancing.3. Preparation of gelatin microspheres: the precise amount of liquid paraffin 30mL in250mL conical flask, added 450L 0.05g/mL Span 80 and stirred. Water bath was heated to55 60, 10mL 0.05g/mL of gelatin solution were added, emulsified und
14、er 60 for 10min.Then ice bath till the temperature dropped to below 10, 50L 50% glutaraldehyde wasadded with the ice bath removing, cured for 2h.Washed with acetone for 3-4 times, themicrospheres prepared was immersed in 10mL acetone to stand for some time under 4 ,filtered acetone off and dried the
15、m to get the ones.4. The pH was 3.5, the time was 120min and the optimum temperature was 35 45 inthe system of adsorption of Gelatin microspheres for polyphenols. The amount of polyphenolsII西华大学硕士学位论文adsorbed by per mass microspheres could reach to the maximum while the mass ratio ofpolyphenols/micr
16、ospheres was 1:1. When the mass ratio was 1:5, the adsorption rate ofgelatin microspheres was 54.86% for EGCG, 78.01% for punicalagins, 54.94% forproanthocyanidins and 7.42% for chlorogenic acid.5. Take EGCG for example, the desorption rate of microspheres for the adsorbedpolyphenols could be to 100
17、% when the ratio was 1:0.5 with the method of high temperaturewater bath. Gelatin microspheres were repeated using for 10 times and could be achievedrespectively till the 8th time. The adsorption rate was up to 72.6% at the 4th and the highestdesorption rate was 62.5%.Key Words: polyphenol； gelatin；
18、complex ；microspheres；adsorb；desorb；reuseIII明胶与多酚的相互作用研究目 录摘 要.IAbstract . II1 引 言 11.1 植物多酚简介. 11.1.1 植物多酚的概念及其分布 11.1.2 植物多酚的分类与结构 11.1.3 植物多酚的理化性质与生物活性 21.1.4 植物多酚的应用 31.2 明胶与多酚的相互作用概述. 31.2.1 明胶与多酚的相互作用机理 31.2.2 明胶与多酚相互作用力 41.2.3 明胶与多酚相互作用的影响因素 41.2.4 明胶与多酚相互作用在食品中的应用 51.3 含量测定方法简介. 51.3.1 沉淀反应中
19、多酚含量的测定 51.3.2 多酚含量测定 51.4 明胶简介. 51.4.1 明胶的性质及用途 51.4.2 明胶微球的制备方法 61.4.3 明胶微球的应用 71.5 本文研究的目的、意义与内容. 71.5.1 本文的研究目的、意义 71.5.2 本文的研究内容 82 材料与方法 92.1 试剂与设备. 92.1.1 实验试剂 92.1.2 仪器与设备 92.2 试验方法 92.2.1 多酚含量测定 92.2.2 明胶-多酚沉淀反应. 11IV西华大学硕士学位论文2.2.3 明胶微球的制备试验 122.2.4 明胶微球的静态吸附试验 122.2.5 明胶微球的静态解吸试验 132.2.6
20、明胶微球的重复利用试验 133 结果与分析 153.1 明胶溶液与多酚的反应试验. 153.1.1 多酚种类对反应的影响 153.1.2 明胶浓度对反应的影响 173.1.3 反应时间对反应的影响 203.1.4 多糖对反应的影响 223.2 明胶微球的形态表征. 253.3 明胶微球静态吸附试验. 263.3.1 明胶微球对 EGCG的静态吸附. 263.3.2 明胶微球对安石榴苷的静态吸附 293.3.3 明胶微球对原花青素的静态吸附 323.3.4 明胶微球对绿原酸的静态吸附 353.4 高温水浴解吸附试验. 383.4.1 多酚种类对解吸的影响 383.4.2 温度对解吸的影响 393
21、.4.3 pH对解吸的影响 413.4.4 时间对解吸的影响 423.5 明胶微球重复利用试验. 424 讨论 444.1 明胶-多酚沉淀反应 444.1.1 多酚种类对反应的影响 444.1.2 明胶浓度对反应的影响 444.1.3 时间对反应的影响 444.1.4 多糖对反应的影响 444.2 明胶微球的制备. 454.3 明胶微球-多酚吸附试验 454.3.1 多酚种类对吸附试验的影响 454.3.2 质量比对吸附试验的影响 45V明胶与多酚的相互作用研究4.3.3 温度对吸附试验的影响 464.3.4 时间对吸附试验的影响 464.4 明胶微球解吸试验. 464.4.1 温度对解吸的影
22、响 464.4.2 pH值对解吸的影响 464.4.3 时间对解吸的影响 464.5 明胶微球重复利用试验. 475 结论 48参 考 文 献 49攻读硕士学位期间发表论文及科研成果 53致 谢 54VI西华大学硕士学位论文1引 言1.1植物多酚简介1.1.1植物多酚的概念及其分布人类最早利用植物多酚始于鞣革的出现，他们发现，将动物的毛皮和某些植物用水泡在一起，皮会变得更坚韧，不易被损坏；Seguin （1796）首次提出“单宁”，Bate Smith（1962）定义“ 单宁” 为能与生物碱、明胶及蛋白 质发 生沉淀，分子量在 5003000的水溶性酚类化合物； Haslam（1981 年）提
23、出“植物多酚” ，包括所有分子结构不同的单宁及单宁类化合物 14。上世纪 80 年代末，开始了对植物多酚的研究。植物多酚有多个羟基，广泛存在于植物体内，是植物体内重要的次级代谢产物，可通过莽草酸途径和丙二酸途径合成5。在水果中，酚酸类物质（如对羟基苯甲酸等）、羟基肉桂酸类物质（如绿原酸、芥子酸、阿魏酸、香豆酸和咖啡酸等）、烷醇类、黄酮醇类和花色苷类含量较丰富，简单的多酚含量相对较少，羟基肉桂酸类物质与葡萄糖或有机酸结合形成酯而存在67。在茶叶中，含有 2025%的多酚，主要以黄烷醇类为主，儿茶素又是黄烷醇的主要成分8。多酚在可可植物、蔬菜、一些谷物中的含量也很丰富。1.1.2植物多酚的分类与结
24、构1920年，有人按照结构的不同，将植物多酚分为缩合单宁和水解单宁；1989年，有人将多酚分为聚黄烷醇类和聚棓酸酯类910。按存在形式的不同，植物多酚可分为游离态、结合态、酯化态三种，原花青素、类黄酮类属于游离酚，酚酸类大多为结合酚或酯化酚；按来源的不同，植物多酚可分为茶多酚、石榴多酚、葡萄多酚和苹果多酚11。茶多酚中，表没食子儿茶素没食子酸酯的抗氧化活性最强；石榴多酚中，安石榴苷的含量最丰富；葡萄多酚中，原花青素的含量最多；苹果多酚中，绿原酸的含量最高。表食子儿茶素没食子酸酯（C22H18O11，Epigallocatechin gallate，EGCG ）属于儿茶素类，在绿茶中含量丰富。安
25、石榴苷（C48H28O30，Punicalagin ）属于水解单宁，易溶于水，被人体吸收后，在酶的作用下，可分解为鞣花酸。具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤等作用，已被广泛应用于化妆品领域。安石榴苷在石榴科植物中含量丰富，目前仅能从该植物中提取获得12。原花青素（Proantho Cyanidins）呈红棕色，溶于水，在葡萄、紫薯中含量丰富。绿原酸（C 16H18O9，Chlorogenic acid）在 5水中的溶解度 为 4%，在热水中的溶解度更大。绿原酸在苹果、杜仲中含量丰富，其来源主要有两种：一是化学合成，即咖啡1明胶与多酚的相互作用研究酸与奎尼酸发生反应，生成缩酚酸；一是植物提取，即在有氧条件
26、下经莽草酸途径产生，是一种苯丙素类化合物13。绿原酸很不稳定，高温或长时间加热会影响其含量14。OHHOOOHHOOHO O OHOOOHOHO OOHO OHOOH OHOO O OOH HOHOOOH OOHO OHHO HO OHHO OH表食子儿茶素没食子酸酯 安石榴苷EGCG PunicalaginOHOHOHO OHHOOHO OHOOHOOH OHOHHOHO OOH原花青素 B3Procyanidin B3绿原酸Chlorogenic acid1.1.3植物多酚的理化性质与生物活性植物多酚的一个重要化学特征是多酚可通过疏水键和氢键与蛋白质、多糖等大分子物质发生结合反应，多酚中的
27、酚羟基易被氧化，也可与金属离子结合可发生络合反应1517。茶多酚耐酸，在pH27时较稳定，pH超过8 或见光时不稳定，易氧化变色，呈红2西华大学硕士学位论文褐色。在碱性条件下，发生氧化聚合。此外，植物多酚还具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗病毒、预防心脑血管疾病、清除自由基、防龋齿、美白等功效18-20 。1.1.4植物多酚的应用(1)在医药保健 领域中的应用多酚与蛋白质的络合，使得多酚在一定程度上会影响人体对蛋白质的吸收21。由此，很多研究者把重点放在如何去除多酚上。但也有人利用这一特征反应，生产出含多酚较多的减肥茶、功能食品，可起到预防肥胖、促进身体健康的作用。(2)在食品领域中的 应用蔬菜
28、、水果、谷物、啤酒、饮料中富含多酚，尤其是没有完全成熟的蔬果中，含有大量的单宁酸，唾液蛋白与之结合会产生涩味，影响口感2223 。多酚暴露在空气中发生褐变，影响食物色泽。然而，苹果、石榴、葡萄、绿茶等植物的颜色各异，正是由于其内含有的多酚的含量所决定的。同时，植物多酚具有抗氧化、清除自由基的作用，因此，从植物中分离提取多酚，可作为着色剂、抗氧化剂和防腐剂。(3)在化妆品领 域中的应用植物多酚具有抗氧化、抗紫外线等作用，越来越多的研究者将多酚应用在护肤品、化妆品中。多酚可与多糖、多元醇、脂质、多肽等发生反应，起到保湿、祛斑、调理的作用24 。(4)在其他领域的 应用在石油勘探中，多酚可作为泥浆处
29、理剂。在陶瓷工艺中，缩合类单宁可制作胶黏剂。在纺织品中，单宁酸是最常用的染色固化剂。在环境保护中，多酚与金属盐络合后，可吸附氨气和 H2S，净化室内空气。另外，多酚还可用于金属涂层，防腐防锈。1.2明胶与多酚的相互作用概述1.2.1明胶与多酚的相互作用机理明胶与多酚相互作用的机理2527 ：明胶的结构中含有氨基和羧基，多酚的酚羟基与之反应，形成多点交联，在明胶分子之间构成网状，最终形成混浊沉淀。该反应过程是可逆的。当多酚含量一定时，如果明胶过量，沉淀消失。其反应过程如下：向一定浓度的多酚溶液中添加一定浓度的明胶溶液，大量的多酚分子聚集在明胶表面形成疏水层，多酚的分子数目越多，明胶表面的疏水性就
30、越大，直至使蛋白质从溶液中沉淀析出；3明胶与多酚的相互作用研究继续添加明胶溶液，当明胶的结合点总数与多酚的结合点数相同时，多酚与明胶发生交联，产生络合物；当明胶的量继续增加时，多酚的含量相对较低，明胶表面的结合点多于多酚的羟基数，多酚与明胶形成的交联网状结构受到破坏，混浊沉淀物减少；对于分子量小的多酚，如果它们的浓度足够大，也可在明胶的表面形成疏水层，从而形成沉淀。1.2.2明胶与多酚相互作用力Russell认为，水解类多酚与明胶的相互作用力主要是氢键与离子键；1988年，E.Haslam等人认为明胶与多酚的相互作用力主要是疏水键和氢键，并提出了“ 手套-手”的作用模式；一些研究者认为，在适宜
31、的 pH下，明胶与多酚的相互作用主要是 键；Endres认为，明胶与多酚的 结合是通过共价键，而一些研究者 则认为其明胶与多酚的相互作用主要是氢键结合，并不存在共价键2830。1.2.3明胶与多酚相互作用的影响因素(1) 多酚的分子量多酚与明胶是否能生成沉淀取决于多酚的分子量31。分子量越小，酚羟基的数目越少，与明胶发生碰撞时，结合能力越弱。一般的，分子量超过500时，多酚与明胶发生反应，生成沉淀。分子量在5001000时，生成的沉淀随着多酚分子量的增加而增加。然而，分子量越大，水溶性越弱。当分子量超过3000时，多酚与蛋白质不能形成沉淀。(2) 多酚的种 类多酚种类的不同影响反应时间和反应程
32、度。缩合单宁反应完全只需15min，单宁酸则需要24h才能反应完全32。(3) 质量比有研究发现33，麦醇溶蛋白与单宁酸发生反应，当麦醇溶蛋白与单宁酸的质量比为2:1或5:1时，产生的混浊较其它比例的多。(4) 反应温度一般的，温度越高，分子运动越剧烈，从而加速反应。同时，温度越高，明胶分子内的疏水基团暴露的越充分，增加了其与多酚羟基的碰撞机会。(5) pH一般的，在明胶等电点附近，分子间的作用力最小34。此时，多酚与明胶之间的结合力大于明胶分子间的作用力，多酚与明胶的络合程度达到最大。4西华大学硕士学位论文1.2.4明胶与多酚相互作用在食品中的应用果汁中的多酚与蛋白质发生络合反应，是果汁浑浊
33、的一个重要原因。当果汁中单宁酸含量较高时，唾液蛋白与之结合，产生涩味。明胶作为一种蛋白质，被广泛的应用于果汁澄清中，其依据就是明胶与多酚的相互作用35 。1.3含量测定方法简介1.3.1沉淀反应中多酚含量的测定多酚与明胶反应生成的絮状物使得溶液浑浊，因此可采用浊度法测定其反应程度，可于 630nm下测定其吸光度 A。1.3.2多酚含量测定目前最常用的多酚含量测定方法主要有福林酚法（FC法）、酒石酸亚铁法、磷钼戊酸法等3640。其中，FC法的原理是在碱性条件下酚 类化合物将六价的钨还原呈五价，生成蓝色的物质，于 760nm下测定，多酚含量越高， 颜色越深。此方法操作简单，精密度高，但抗坏血酸、蛋
34、白质对其有干扰。酒石酸亚铁法的原理是在 pH7.5 下，多酚类物质与亚铁离子反应，生成蓝紫色络合物，在 540nm 下测定。此方法简便快速、回收率高，是国标推荐的饮料中多酚的检测方法。磷钼钨酸法的原理是在碱性条件下，多酚将磷钼戊酸还原，生成深蓝色物质，于 760nm下测定。1.4明胶简介1.4.1明胶的性质及用途明胶是由氨基酸组成相同而分子量不同的多肽分子组成的一种蛋白质，结构中含有大量的羟基、羧基和氨基，分子量一般为 10000200000。明胶是一种两性化合物，具有极强的亲水性，其胶团带电，在电场作用下，会向两极中的某一极移动。明胶易溶于温水中，其溶液在室温下会形成凝胶，易受温度、湿度等因
35、素的影响发生变质。因此明胶溶液不便于保存。按用途分，明胶可分为食用明胶、药用明胶、工业明胶和照相明胶。食用明胶含有甘氨酸、脯氨酸等人体所需的 18种氨基酸，被广泛应用于医用软硬胶囊、食品添加剂、等食品行业，其标准执行 GB6783-94。5明胶与多酚的相互作用研究1.4.2明胶微球的制备方法微球是由有机或无机聚合物组成的微球粒子，直径通常为 20nm2000nm，其制备方法主要有化学法、物理法和物理化学法三大类4145 。化学法分为聚合法和交联法。聚合法：将单体化合物分散到介质中，加聚或缩聚后制得微球。交联法：将聚合物溶液分散到另一溶液中，添加化学交联剂，交联后制备微球。明胶溶液在室温下容易发
36、生凝胶，可将其乳化后，再进行交联。该方法所需设备简单，操作方便。物理法是机械的方法，借助外力将材料分隔成球状。物理化学法包括喷雾干燥法、凝聚法和乳化凝聚法等。其原理在于析出，即改变条件，使溶液析出固体，制得微球。该方法所需设备复杂，制得的微球直径不均一。采用乳化-交联法，制备明胶微球，微球不仅具备具备明胶本身的特性，还具有以下特性：a. 比表面积大，吸附位点多，吸附率高；b. 微球表面有羟基、羧基、氨基等活性基团，可将化学物质或生物分子牢牢的连接在微球表面；c. 粘度小，在溶液中的分散度高；d. 固液分离设备简单，操作方便，成本低；e. 将液体转化 为固态，方便利用、运 输和贮存。采用乳化-交
37、联法制备明胶微球，是目前微球制备的常用方法。选用食品级明胶，配制成一定浓度，在某一温度下乳化后交联制得的。(1)乳化装置明胶微球的制备是由明胶溶液经乳化后再交联制得的，在乳化过程中搅拌速度和乳化温度对微球的形态有关键作用。乳化需要高速搅拌，并保持恒温，结合研究和实际情况可选择不同的乳化装置。常用的乳化装置有机械搅拌器、转子-定子搅拌器、高压均质机等，控温装置可选用常用的数显恒温水浴锅。(2)乳化剂乳化剂是一种表面活性剂，可与明胶相互作用，增进其网络结构，增加体积，乳化剂可分为水包油和油包水 W/O型。一般用“ 亲水亲 油平衡值”（HLB）表示乳化能力。HLB愈大，亲水作用愈大，适用于 O/W型
38、； HLB愈小，亲油作用愈大，适用于 W/O型。可根据具体需求选择适合的乳化剂。司盘-80属于 W/O型，可作为食品乳化剂单独使用，在饮料中的使用量不得超过 0.05g/kg。(3)交联剂6西华大学硕士学位论文交联剂作用是将线型支链型的大分子转化为网状结构，提高强度、耐热性等。戊二醛是一种常用的交联剂，当其浓度为 1%时，交联度已达到很高的程度，交联度随浓度下降而下降。除了上述因素外，影响微球形态的因素还包括明胶浓度、搅拌速度、乳化温度、交联时间等。适宜的条件，制得的微球表面光滑，大小均一。1.4.3明胶微球的应用明胶微球在材料、医药、生物、环境等领域已得到广泛的应用，为人类健康作出了重要的贡
39、献46-50 。(1)材料上世纪 30年代，微球因其具有吸附、离子交换等特性，在色谱、催化剂等领域得到应用。5060 年代，研究者将聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和多糖制成微球，用作柱层析的填充剂。70年代，人们利用悬浮法制备硅胶微球，用作离子交换剂，用作色谱柱填充剂。(2)医药60年代，微球在体内诊断、放射治疗中得到应用。而今，利用微球技术实现药物包埋的技术，早已被广泛应用于医药领域。(3)生物技术在20年代，微粒材料就被用于凝集测试、血液循环等生物学研究。(4)环境保护采用乳化交联法制备的明胶微球已被应用于吸附染料中的色素以及船舶防污行业。1.5本文研究的目的、意义与内容1.5.1本文的研究目的、意
40、义有文献报道51，明胶溶液须在一定的浓度范围内才能与多酚络合生成沉淀。明胶溶液储藏在常温下呈半凝固状态，故可将明胶溶液制成明胶微球，方便保存和使用。明胶是制备微球的一种优质材料，明胶微球具有良好的吸附性能，在生物、化学、化工等领域早已广泛被应用。将一定浓度的明胶溶液制成微球吸附多酚，应用于食品领域，以此探索一种新的去除鞣质的方法。越来越多的研究者把重点放在如何去除蔬果汁中的鞣质，而对去除多酚的回收利用的研究报道较少。本实验采用乳化-交联法制备明胶微球，以EGCG、安石榴苷、原花青素、绿原酸为例，探究一种更加有效、方便、 稳定、快捷的去除和回收多酚，并能多次重复利用明胶的新方法。7明胶与多酚的相
41、互作用研究1.5.2本文的研究内容本论文主要研究了明胶与多酚的相互作用，其研究内容包括：(1) 明胶与多酚的 络合反应。(2) 明胶与多酚的猝 灭。(3) 明胶微球的制 备。(4) 明胶微球静 态吸附试验。(5) 明胶微球静 态解吸附试验。(6) 明胶微球的重复利用 试验。8西华大学硕士学位论文2材料与方法2.1试剂与设备2.1.1实验试剂表食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）(98%)、安石榴苷(98%)、原花青素(95%)、绿原酸( 98%)均购自成都曼斯特生物科技有限公司。液体石蜡、司盘 80、50%戊二醛、丙酮、酒石酸钾钠、硫酸亚铁、柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯，购
42、自成都市科龙化工试剂厂。食品级明胶、蔗糖、果胶、黄原胶。2.1.2仪器与设备UV- 2600紫外- 可见分光光度计TDL-408离心机购自北京瑞利分析仪器公司；购自星科科技公司；电子分析天平 购自上海良平仪器仪表有限公司；购自北京医疗设备厂；恒温水浴锅GSr-2精密增力电动搅拌器精密数字式酸度计pHs-3C型KQ-100DE型超声波清洗器Nikon Eclipse Ti-S倒置荧 光显微镜DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱电子扫描显微镜购自上海雷磁仪器厂；购自昆山市超声仪器有限公司；购自上海齐欣科学仪器有限公司；微量移液器 购自Thermo 公司；移液枪其它仪器设备均为实验室常用仪器设备。2
43、.2试验方法2.2.1多酚含量测定FC法与磷钼钨酸法所需的 试剂磷钼戊酸配置起来比 较麻烦，故可采用酒石酸亚铁分光光度法测定纯多酚含量。酚类物质中的酚羟基遇亚铁离子发生络合反应，有蓝紫色络合物生成。该方法是 GB/T 8313中茶多酚的测定方法。(1)0.1mol/L柠 檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH3.5 ）的配制9明胶与多酚的相互作用研究称取 5.2530g柠檬酸于 500mL烧杯中溶解，并于 250mL容量瓶中稀释至刻度，制得 0.1mol/mL柠檬酸溶液。称取 7.3525g柠檬酸三 钠于 500mL烧杯中溶解，用 250ml容量瓶稀释至刻度，制得 0.1mol/L柠檬酸三钠溶液。分别精密
44、量取 150mL柠檬酸溶液和 100mL柠檬酸钠溶液，混匀，调 pH至 3.5。(2)0.2 mol/L磷酸 缓冲液（pH7.5）的配制称取 17.9125g Na2HPO3于 500mL烧杯中，溶解，转移至 250mL容量瓶中，稀释至刻度，得到 0.2mol/L Na2HPO3溶液，备用。称取 7.8001g NaH2PO3于 500mL烧杯中，溶解，转移至 250mL容量瓶中，稀释至刻度，得到 0.2mol/L NaH2PO3溶液，备用。分别精密量取 200mL Na2HPO3溶液和 50mL NaH 2PO3溶液，混匀，调 pH至 7.5。(3)酒石酸亚铁 溶液的制备分别称取 1.249
45、5g酒石酸钾钠和 2.5030g硫酸亚铁于 500mL烧杯中溶解，用 250mL棕色容量瓶稀释至刻度。(4)多酚含量的测定标准曲线的绘制：称取 22mg的多酚于 25mL棕色容量瓶中，配成一定浓度的多酚溶液。分别吸取 0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL该多酚溶液于 25mL棕色容量瓶中，向其中分别加入 5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0mL pH3.5 缓冲液，均加入 5.00mL酒石酸亚铁溶液，将其混合均匀，用 pH7.5缓冲液稀 释至刻度。静置 10min ，于 540nm 下测定多酚含量。表 2.1 多酚标准曲线绘制Table2.1 Drawing
46、 of polyphenols standard curve组号 1 2 3 4 5 6多酚溶液（mL）pH3.5缓冲液（mL）酒石酸亚铁（mL）pH7.5缓冲液0 1.004.002.003.003.002.004.001.005.0005.005.00定容，静置 15minOD纯多酚含量的测定：取 5mL样品溶液于 25mL棕色容量瓶中，向其中加入 5mL酒石酸亚铁溶液，混匀，用 pH7.5缓冲液稀释至刻度。静置 10min，于 540nm 下测定多酚含量。10西华大学硕士学位论文2.2.2明胶-多酚沉淀反应(1)多酚种类试验0.88g/L多酚（EGCG、安石榴苷、绿原酸、原花青素）分 别
47、与 20g/L明胶溶液等体积反应，总时间为 150min，反应温度为 30。设 置一组未添加明胶的同浓度多酚作为空白对照，于 630nm下测定吸光度 A。(2)反应浓度试验0.88g/L的多酚溶液与一定浓度的明胶溶液于 30下反应 120min，设置明胶浓度梯度：0.2、0.5、0.75、1、3、5、10、15、20g/L，设置一组未添加明胶的同浓度多酚作为空白对照，于 630nm下测定吸光度 A。绘制吸光度-反应浓度曲线，确定最佳反应浓度。(3)反应时间试验将 0.88g/L的各多酚与浓度为 5 g/L的明胶溶液于 30下反应，设置反应时间梯度：5、15、30、45、60、90、120、15
48、0、180、210、240min，设置一组未添加明胶的同浓度多酚作为空白对照，在 630nm下测定反应物的吸光度 A。绘制吸光度-反应时间曲线，确定最佳反应时间。(4)反应温度试验将 0.88g/L的各多酚与浓度为 5 g/L的明胶溶液反应 120min，设置温度梯度：20、25、30、35、40、45、50、55，设置一组未添加明胶的同浓度多酚作为空白对照，并在 630nm下测定反应物的吸光度 A。绘制吸光度-反应温度曲线，确定最佳反应温度。(5)多糖用量试验因多酚可与多糖结合，以多糖的用量为影响因子，设计用量梯度试验。在 10mL0.88g/L的多酚中分别添加一定浓度的多糖，混匀后静置 3
49、0min。向其中加入 10mL 5 g/L的明胶溶液，于 30下反 应 120min。设置蔗糖、果胶体 积梯度均为：0、0.5、1、2、3、4、5 mL，黄原胶体积梯度为：0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10mL，设置一组未添加明胶的同浓度多酚/多糖作为空白对照，在 630nm下测定反应物的吸光度 A 。表 2.2 多糖对络合反应的影响试验Table2.2 The effect of polysaccharides on complexation reactions多糖 体积（mL）14g/L蔗糖 0000.50.50.51112223334445550.4g/L果胶0.009g/L黄原胶 6 8 10分别与 10mL 0.88g/L的多酚混匀，静置 30min加入 10mL 5 g/L的明胶溶液，于 30下反应11明胶与多酚的相互作用研究2.2.3明胶微球的制备试验(1)微球的制备采用乳化交联法，以液体石蜡为液相，一定浓度的明胶溶液为水相，司盘 80
