1、应用 RT-PCR 技术评估腹腔冲洗量对于清除肿瘤脱落细胞的影响Use of RT-PCR to assess the effect of irrigation volume on the efficiency on rectal washout徐啸，王文友，彭家远作者单位：315324 浙江省宁波市，慈溪市第三人民医院普外科（徐啸，王文友） ；上海交通大学附属上海市第六人民医院普外科（彭家远）摘要：目的：应用 RT-PCR 技术评估腹腔冲洗量对于胃癌 D2 根治术清除腹腔肿瘤脱落细胞的影响方法：72 例进展期胃癌患者行 D2 根治手术，按冲洗量分为 A、B 、C 三组。A 组冲洗量在1000
2、ml, B 组冲洗量在 2000ml, C 组冲洗量在 3000ml。留取冲洗后的腹腔残留液体，RT-PCR 法检测冲洗液中 CEA mRNA 及 CK20mRNA 的表达水平，同时与细胞学检测的结果做对比结果：RT-PCR 法 A、B、C 三组患者胃冲洗液肿瘤脱落细胞的阳性检出率分别为29.2%(7/24 例)、16.7%(4/24 例)和 4.2%（1/24 例） ，具有统计学差异（P=0.03 ） 。细胞学的三组的阳性检出率分别为 20.8%（5/24 例） 、8.3%（2/24 例）和 0.0%（0/24 例） 。结论：随着胃冲洗量增加，肿瘤脱落细胞的检出率逐步降低，胃冲洗量至少应在
3、3000ml以上以有效清除脱落癌细胞。RT-PCR 具有高灵敏度，是对细胞学检测很好的补充。关键词：RT-PCR ，胃癌，腹腔冲洗AbstractAim: Assess the effect of irrigation volume on the efficiency on peritoneal lavage using RT-PCRMethods: 72 cases of advanced gastric cancer were enrolled and intraoperative peritoneal lavage fluids were collected. They were div
4、ided into three groups according to the irrigation volume : group A with 1000ml, Group B with 1500ml and Group C with 2000ml. the level of CEA mRNA and CK20 mRNA in the three groups were evaluated by RT-PCR and the results were compared with that of cytological examination.Results: the detective rat
5、e of exfoliated cancer cells by RT-PCR in three groups was 29.2%(7/24cases), 16.7%(4/24cases) and 4.2%（1/24 cases）respectively (P=0.03). And the rate by cytological examination was 20.8%（5/24cases）,8.3%（2/24cases）and 0.0%（0/24cases ）.Conclusion: detective rate of exfoliated cancer cells decreased wi
6、th the increase of irrigation volume for peritoneal larvage t. Large Volume no less than 3000ml and repeated washout might be sufficient to eradicate exfoliated cancer cells. With a high sensitivity, RT-PCR is an ideal supplemental method to detect exfoliated cancer cells.Key words: RT-PCRm gastric
7、cancer, peritoneal lavage1.引言腹膜转移或复发是进展期胃癌常见的复发转移途径，标准根治术 D2 手术能够引起腹腔的播散 1，术后行腹腔冲洗被认为是降低腹膜转移的有效方法，但是目前对于腹腔冲洗的量无定论，关键的因素之一缺乏有效的检测肿瘤脱落细胞的手段，导致对于冲洗的效果难以评价，既往的细胞学检测准确性不高，显微镜下观察容易受到一些白细胞、间皮细胞等干扰，产生误差。既往研究证实采用 RT-PCR 同时检测胃癌腹腔冲洗液 CEA 及 CK20 的表达是一种较为灵敏的手段，能够较准确的预测术后腹膜的转移和复发。因此本研究采用RT-PCR 技术检测胃癌术后冲洗液中肿瘤细胞 CE
8、A mRNA 及表达情况，客观评估腹腔冲洗量对于清除胃癌脱落细胞的影响。材料和方法2.1 一般资料病例入选标准：2010 年 1 月-2012 年 12 月 CT 及超声胃镜病理诊断明确为进展期胃癌；手术中证实浆膜侵犯，肉眼无可见腹膜转移病灶。共选择符合标准的患者共 72 例，其中男43 例，女 29 例，年龄 35-77 岁，中位年龄 59 岁。按照用简单随机抽签法将其分为A、B 、 C 三组。 A 组冲洗量在 1000ml, B 组冲洗量在 2000ml, C 组冲洗量在 3000ml。收集同期 21 例经手术治疗胃溃疡患者腹腔冲洗液作为阴性对照，阴性对照组用简单随机抽签法将其分为 D、E
9、、F 三组。D 组冲洗量在 1000ml, E 组冲洗量在 2000ml, F 组冲洗量在 3000ml，每个数量级 7 例。上述患者的诊断均经病理学证实。所有胃癌患者均采用标准 D2 根治术，消化道重建后，给以不同量的生理盐水冲洗腹腔。冲洗完后吸净大部分腹腔积液，在以 PAD 纱布擦干腹腔之前，分别于瘤床、Douglas窝，肝肾隐窝，脾窝以无菌滴管取残留冲洗液约 100ml。阴性对照组取样方法与胃癌患者。2.2 脱落细胞的检测干净的容器收集冲洗液之后送病理科检查脱落细胞。检查时将冲洗液静置 15min，将标本分为两份，一份 800r/min 进行 10 分钟离心做细胞涂片, 沉淀涂片给予瑞氏
10、染色，光学显微镜下查找脱落的癌细胞; 第 2 份 4下 10000r/min 离心 10 分钟后，立刻用 Trizol 法提取 RNA,经凝胶电泳检测 RNA 的完整性后放入- 80 冰箱保存以备行 RT-PCR 检测2.3 脱落癌细胞数量评级镜下找到癌细胞的依据是细胞具有明显恶性特征，细胞形态异型，大小不均，胞浆丰富，核不规则，核浆比失调，核染色质增粗增多而且分布不均，核仁大，有的可见多个核仁细胞排列紊乱，成巢状或散在分布，边界不清脱落癌细胞的数量评级由我院两位病理科医师独立评估，评估前病理科医师对患者资料不知晓。两位医师结论有差异时，交由第三位高年资医师做评估2.3 RT-PCR 检测冲洗
11、液中 CEA mRNA 及 CK20mRNA将提取的总 RNA 进行逆转录,按照逆转录试剂盒说明(美国 Promega 公司) 进行,反应条件:30 10min,55 30 min,99 5 min,15 个循环。提取细胞 cDNA 进行 PCR 扩增: 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成,CEA 上游引物: 5-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTC2TCAGCTGG-3,下游引物 : 5-TGTAGCTGTTG2CAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3； CK20 上游引物：5-TGCTACTTACCGCCGCCTTC-3, 下游引物：5-CCTTGCCATCCAC
12、TACTTCTTGC-3。内参照 GAPDH 上游引物: 5-CCCATCACCATCTTCCAGG-3, 下游引物 5-CATCACGCCACAGTTTCCC-3,扩增产物长度为 379bp。扩增条件: 94 10min,94 30 秒 ,56 30 秒, 72 30 秒,40 个循环; 72 延伸 2min,冷却至 4 。取 5l 扩增产物在 2%琼脂糖凝胶电泳 45min,经凝胶成像系统(美国 Bio2Rad 公司) 分析。CEA 及 CK20 同时表达视为阳性，即冲洗液内存在癌细胞，仅 CK 表达为阴性结果（图 1） 。2.5 统计学方法应用 SPSS 软件包进行统计分析 两组间率的比
13、较应用卡方检验。P60 岁 16 8 1560 岁 15 17 15手术方式根治性远端胃切除（毕I 式）10 8 11根治性远端胃切除（毕II 式）8 7 5根治性全胃切除6 9 8手术时间（分钟）171.53 168.73 182.55肿瘤分期（TNM）NSII 1 1 2III 11 13 11IV 12 10 11肿瘤直径 NS3 厘米以下 2 2 13-5 厘米 19 17 195 厘米以上 3 5 4分化程度高 0 0 0中 12 10 10低 12 14 14Lauren 分型 NS隆起型 0 1 0溃疡局限型 10 12 12溃疡浸润型 12 9 10弥漫型 2 3 2表 2 三
14、组患者细胞学与 RT-PCR 法检测脱落细胞的比较A B C阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性阳性(n) 4 1 2 0 0 0阴性 3 16 3 19 1 237 17 5 19 1 23讨论：腹腔转移是严重影响胃癌预后的因素之一2,3 ，腹腔内肿瘤细胞脱落是形成转移的先决条件，除去肿瘤本身的因素，标准的 D2 手术也会引起腹腔内游离癌细胞的出现 1。目前对于清除腹腔游离癌细胞的最简便手段之一是腹腔冲洗，但是对于冲洗的量尚无定论，最主要的原因是缺乏理想的检测脱落细胞的方法。既往研究基本在显微镜下观察肿瘤的脱落细RT-PCR1细胞学胞，但此方法有相当的局限性，首先检测的医生必须细致耐心；其次冲
15、洗液中常混有上皮细胞、血细胞或炎症细胞，干扰医生的判断；再有冲洗用的溶液渗透压、送检的时间、离心时所用的转速常常导致脱落细胞自溶。上述者因素均不同程度降低了该方法的实用价值。RT -PCR 技术敏感性可达到每 106107 个正常组织细胞中仅存 1 个肿瘤细胞即可被辨认，这是现有的细胞病理学和免疫组化法所无法达到的检测水平。受此启发，我们采用 RT-PCR 检测脱落细胞来评估冲洗量对于清除脱落肿瘤细胞的影响，本研究同时检测 CEA 及CK20 是基于以下考虑：CEA 是常用的检测胃癌脱落细胞的靶 RNA4，CK20 是细胞骨架系统中间丝的组成成分之一，联合 CK20 检测避免一些间叶细胞内 C
16、EA 的干扰，提高了检测的特异性5。本研究发现，无论冲洗量多少，RT-PCR 的检测阳性率均高于细胞学检测，说明 RT-PCR 法对于常规的细胞学检测是较好的补充，能够降低漏诊率。此外，我们的研究发现，无论是使用细胞学或是 RT-PCR 法检测，随着冲洗量的增加，肿瘤脱落细胞的检出率明显下降，我们的 RT-PCR 的结果也提示，冲洗量达到 3000ml 时，说明在胃癌手术后，常规的腹腔冲洗必需采用较大量的液体，以有效降低可能的术后腹腔复发，必要时可以加用化疗药物浸泡。综上所述，术中胃冲洗量必须大于 3000ml 有效清除脱落细胞。而联合 CEA mRNA 和CK20mRNA RT -PCR 对
17、于检测腹腔残留肿瘤细胞有较高的灵敏度，是对细胞学检测良好的补充, 能识别出免疫组化方法的遗漏,大大提高了胃肠癌脱落细胞检出率,帮助防止或减少术后的局部复发, 有相当的临床实用价值。Reference1. Yu XF, Ren ZG, Xue YW, et al.: D2 lymphadenectomy can disseminate tumor cells into peritoneal cavity in patients with advanced gastric cancer. Neoplasma 2013;60:174-181.2. La Torre M, Ferri M, Giova
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