1、文章编号：反复缺血预适应对心肌缺血再灌注损伤大鼠 TLR4和致炎细胞因子 TNF-、IL-1的影响罗永金（重庆医科大学附属第一医院胸外科，重庆 400016）摘 要: 目的 探讨缺血预适应(ischemic preconditioning) 对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemical reperfusion injury, MI/RI) 大鼠的具体保护机制。材料和方法 18 只雄性 SpragueDawley 大鼠( 350-400g ）被随机分为假手术对照组(Sham 组)、缺血再灌注组(IR 组) 和缺血预适应组 (IP 组), 每组 6 只大鼠。成功制备上述三种动物
2、模型后, 收集动物外周血和切取病变心肌组织。采用酶标记免疫吸附法 (enzyme-labeled immunosorbent assay, Elisa) 测定动物外周血血清中致炎细胞因子 TNF-、IL-1 的含量; 分别采用 RT-PCR 和 Western blot 技术检测大鼠病变心肌组织中 Toll 样受体-4 (TLR4) 在转录水平和蛋白水平上的变化。结果 相对于 IR 组, 缺血预适应可有效降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中致炎细胞因子 TNF-、IL-1 的水平( p0.01 ); 同时, 相对于IR 组, PC 组中 TLR4 mRNA 和蛋白水平明显下调 ( p0.01)。
3、结论 缺血预适应作为心肌缺血再灌注损伤的内源性保护措施, 其具体作用机制可能与其降低心肌中 TLR4 和外周致炎细胞因子 TNF-、IL-1 的表达密切相关。关键词: 心肌缺血再灌注损伤; 缺血预适应; TLR4; TNF-; IL-1Effect of repeated ischemic preconditioning on TLR4 and proinflammatory cytokines TNF- and IL-1 in myocardial ischemical reperfusion injury rat modelLUO Yong-jinDepartment of cerebra
4、l surgery, First affiliated hospital, Chongqing medical university, Chongqing 400016Abstract： Objective To investigate the protective mechanism of ischemic preconditioning for myocardial ischemical reperfusion injury (MI/RI) rat. Methods 18 male SpragueDawley(SD) rats were randomly separated into Sh
5、am, ischemical reperfusion (IR) and ischemical preconditioning (IP) groups (6 /group ). Peripheral blood and cardiac muscle with pathological change were collected after the establishment of the above three animal models. We employed Elisa to determine proinflammatory cytokines TNF- and IL-1 product
6、ion in sera of these animals. RT-PCR and Western blot was used to assay the transcriptional level and protein level of TLR4 in cardiac muscle tissue with pathological change, respectively. Results Compared with IR group, ischemic preconditioning could effectively decrease the expression levels of TN
7、F- and IL-1 in sera of rats in IP group( p0.01 ). Meanwhile, TLR4 mRNA and protein levels were down-regulated(p0.01 and p0.05 , respectively). Conclusion As an endogenous protective measure, the specific mechanism of ischemic preconditioning for RI might be closely associated with decreasing express
8、ions levels of TLR4 and proinflammatory cytokines such as TNF- and IL-1._作者简介：罗永金，男，硕士研究生，主要从事心脏外科瓣膜置换、先天性心脏病方面的研究。电话: 13983866970收稿日期： 修回日期：Keywords: myocardial ischemical reperfusion injury, ischemic preconditioning, TLR4, TNF-; IL-1缺血预处理( ischemia preconditioning, IPC ) 是由Murry 及其同事于1986 年首先提出的一种
9、对抗心肌缺血、缺血再灌注损伤的内源性保护形式 1 。IPC定义反复多次的短暂心肌缺血对随后更长时间的心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，能提高心肌对缺血的耐受性。因此，预处理是指预先给予某种损伤性刺激，以提高心肌细胞自身抗损伤的耐受性或适应性。IPC是涉及多种因素的复杂过程, 一般可分为内源性触发物的激活、信号传递通路的活化及终末效应物形成等三个过程。研究发现，磷脂酰肌醇-3 激酶( PI3K ) 、蛋白激酶B (Akt ) 、糖原合成酶激酶-3( GSK-3 ) 等信号途径参与了心脏的保护作用 2-6 。最近, 越来越多的证据表明, TLR4 参与了RI 病变过程 7, 8 。事实上, IP 对
10、于RI 时TLR4 表达的影响尚未见报道。在本研究中, 我们采用IP 作用于RI 大鼠模型, 观察其对TLR4 及相关的致炎细胞因子TNF-、IL-1 的影响, 阐明其对于RI 可能的作用机制。1. 材料和方法1. 1 实验材料1. 1. 1 实验动物 18 只雄性 SpragueDawley 大鼠( 350-400g），由第三军医大学实验动物中心提供。1. 1. 2 主要试剂 本实验所用PCR引物均由上海英骏生物技术公司合成; Taq酶、DNaseI（RNase free）购自TaKaRa公司; RNA提取试剂Tripure reagent为ROCHE公司产品; M-Mulv Reverse
11、 Transcriptase购自Promega公司; TLR4一抗( Gen Script ); HRP二抗 (北京博奥森); 内参一抗(北京博奥森); TNF-、IL-1 检测试剂盒(深圳晶美)1. 1. 3 主要仪器 Bio-Rad 核酸蛋白测定仪、PowerPac Basic 电泳仪、192 型 Sub-Cell 电泳槽和全自动凝胶成像系统均由美国 Bio-Rad 公司提供; 2720 型 PCR 仪由美国 ABI 提供。1. 2 实验方法1. 2. 1 动物模型制备 200 g/L 的乌拉坦溶液,按 5 mL /kg 腹腔注射进行麻醉。颈部正中切开皮肤，钝性分离肌肉至气管。气管插管接人
12、工呼吸机（呼吸频率：50 次/分; 潮气量：20ml/kg; 呼吸时比 1:1 ） 。逐层缝合颈部肌肉、皮肤。开胸结扎冠脉左前降支: 胸骨左侧 2mm 切开皮肤，钝性分离肌肉见肋骨，在第四肋间隙用眼科剪轻轻向下分离肋间肌。剪断 3、4 肋骨，用拉钩拉开胸壁，在两侧胸壁肌肉分别穿一双线留小圈在内侧。小心剪开心包膜，用棉签轻压住心脏。在左心耳下缘 34mm 进针，进针深约 1.5mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向出针，针距约 34mm，分别将线两端穿入小圈内。留线暂不结扎（因缝针刺激心脏会出现心律失常） 。稳定10 min 后再收紧结扎线，连同小段聚已烯管结扎（起压迫血管作用） 。立即观察心电图，以出
13、现 QRS 高大增宽为结扎成功标志，记时缺血时间。RI 组: 30 min 后轻拉松结线，打开血管再灌注，立即观察心电图，数分钟后应该出现 QRS 回落变窄。再灌注 120min，注意观察再灌注心律失常。IP 组: 结扎左前降支后，心电监护出现出现 QRS 高大增宽, 确定结扎成功，再复灌 5 min 然后再扎紧 5 min, 又松开复灌 5 min, 如此反复 4 次, 再扎紧 30 min 复灌 120 min。Sham 组: 气管插管接人工呼吸机, 钝性分离肌肉并剪断 3、4 肋骨。1. 2. 2 动物标本收集及处理 模型制备成功后处死动物前，直接抽取右心房血2-3 ml, 4 3000
14、 g 分离出血清，置于-804 冰箱内保存备用; 同时, 迅速切取病变心肌 (包括边缘部分正常心肌)，生理盐水洗净后，放入液氮中保存备用。1. 3 指标检测1. 3. 1 血清TNF-、IL-1的测定 采用Elisa 进行检测, 具体操作步骤参照试剂盒说明书。1. 3. 2 病变心肌组织 TLR4 mRNA 表达水平检测1. 3. 2. 1 RNA 抽提 组织样本从液氮中拿出后, 在冰浴上用PBS清洗、剪碎、研磨,室温下放置5min。加入1 mL Trizol 溶液在玻璃匀浆器中彻底匀浆, 用PBS 洗2 次,离心后吸去上清。加入0.2 ml 氯仿,室温下剧烈振荡15 s,12000 g 离心
15、 15 min; 小心吸取上层无色液相加入异丙醇0.6 ml,室温下静置5 min, 12000 g 离心 10 min;弃上清,加入75%乙醇1 ml 振荡轻轻洗涤后12000 g 离心10 min。弃上清,室温下干燥; 用30 ul Rnase-free ddH 2O 充分溶解,混匀后,采用分光光度计检测A260 / A280的比值以验证RNA的纯度,比值介于 1.6-2.0 时,可用于 RT-PCR 检测。RNA的含量: RNA(g/ml) =A260 44 稀释倍数，余RNA -20保存。1. 3. 2. 2 反转录 各样本均取2 ug RNA, 补Rnase-free ddH2O至1
16、1 ul。于70水浴5 min后立即放在冰浴上，各管中再分别加入以下试剂: 5RT Buffer, dNTPs ( 10 mM ), Rnain, Oligo, M-MLV。总体系为40 ul。于42水浴60 min，70热灭活M-MLV 10min。1. 3. 2. 3 PCR检测 引物 TLR4: Forward: 5-GGACTCTGC CCTGCCACCATTTA-3, Reverse: 5-CTTGTGCCCTGTGAGGTCGTTGA-3, 扩增片段为 2800 bp; -actin, Forward: 5 GTCAGAAGGA CTCCTACGTG- 3, Reverse: 5
17、-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3, 扩增片段为 825 bp。PCR 反应体系如下: First-Strand cDNA 1.0 ul10PCR Buffer 5.0 uldNTP Mix （2.5 mM ） 1.0 ulForward primer （10uM） 1.0 ulReverse Primer （10uM） 1.0 ulTaq Polymerase 0.5 ul补足 ddH2O 至 50.0 ul反应条件: 94预变性1 min; 94变性30 s; 55退火30 s; 72延伸1 min ,共计32个循环, 最后7210 min。电泳: PCR产物10l 与6Buf
18、fer 2 ul 混合上样, 1.5% 琼脂糖凝胶电泳150V 15 min , 紫外透析灯对凝胶成像分析( Bio-Rad, 美国 ) 。电泳条带结果判断：以TLR4 的灰度值与-actin 的灰度值的比值表示TLR4 mRNA 的表达水平。1. 3. 3 病变心肌组织 TLR4 蛋白水平测定 取约 200 mg 组织置玻璃匀浆器内, 立即加入150 L预冷单去污剂裂解液（北京普利莱生物），剧烈振荡15 s, 冰浴10 min。随后超声破碎细胞, 80W, 3 次, 每次约5 s。接着12 000 g、4 离心10min。按 PIERCE 蛋白测定试剂盒说明进行蛋白质定量, 样本分装于- 8
19、0 冰箱中保存备用。将提取液的蛋白浓度调整一致, 各取50 g 蛋白经10% 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE ) 后,湿法转膜至 PVDF 膜上。转膜结束后用含5% 脱脂奶粉封闭6 h, TBS 洗膜3 次, 每次5 min。随后分别加入兔抗大鼠TLR4 单克隆抗体( 60KD ) (1:1000) 和 -actin 单克隆抗体( 43KD ) ( 1:800 ), 4 孵育12 h。TBS 洗膜 2 次, 每次5 min。然后再加入辣根过氧化物 (HRP) 标记羊抗兔IgG ( 1:5000 ), 4 孵育2 h。TBS 洗膜 2 次, 每次5 min。将 A 和 B
20、 两种试剂在保鲜膜上等体积混合，然后加在PVDF膜的正面，温育大概2分钟。进入暗室，将胶片压在PVDF,膜上，依照发光的强度选择不同的曝光时间。将胶片放入显影液中，出现条带后，立即放入定影液中, 流水冲洗胶片后晾干。对胶片进行扫描，然后用UVP凝胶图象处理系统Labworks 4.6 软件分析目的条带的灰度值。结果判断: 以 TLR4 的灰度值与 actin 的灰度值的比值表示TLR4 蛋白相对表达水平。1. 4 统计学处理所有计量资料采用均数标准差( s)。采用 SPSS x10. 0 统计软件进行数据分析, 组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。以 p0.05 为具有统计学意义。2.
21、结果2. 1 缺血预处理血清TNF-、IL-1 表达的影响相对于IR 组, 预处理组大鼠血清中TNF-、IL-1 表达水平明显降低, 且差异具有统计学意义( p0.01 ); p0.05 )。表 1 各组大鼠血清TNF-、IL-1 表达水平( s , n=6 )x组别 TNF- (pg/ml) IL-1 (pg/ml)假手术组 18.853.23 23.385.46缺血再灌注组 33.606.14 a 48.226.73 a缺血预适应组 25.574.89 a, b 36.735.64 a, b注: a p0.01 vs. 假手术组; b p0.01 vs. 缺血再灌注组2. 2 缺血预处理对
22、大鼠病变心肌TLR4 mRNA 的影响在电泳图上 2800 bp 和 825 bp 的位置目的条带和内参照条带, 与设计结果一致。相对于 IR 组大鼠病变心肌 TLR4 mRNA 相对表达水平(0.720.10), IP 组大鼠病变心肌 TLR4 mRNA 的相对表达水平( 0.430.08) 明显降低( p0.01 )。(图 1, 表 2)3000 bp2000 bp1000 bp750 bpTLR4-actinM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18TLR4-actin4000 bp500 bpM: Marker; Line 1-6: 假
23、手术组; Line 7-12: 缺血再灌注组; Line 13-18: 缺血预适应组.图 1. 各组大鼠病变心肌 TLR4 mRNA电泳图表 2 各组大鼠血清TLR4 mRNA 相对表达水平( s , n=6 )x组别 TLR4 /-actin假手术组 0.250.03缺血再灌注组 0.720.10 a缺血预适应组 0.430.08 a, b注: a p0.01 vs. 假手术组; b p0.01 vs. 缺血再灌注组2. 3 缺血预处理对大鼠病变心肌TLR4 蛋白表达的影响各组随机选取 3 个样本进行 Western blot 检测。结果发现, 相对于 IR 组大鼠病变心肌 TLR4 蛋白相
24、对表达水平(0.670.02), IP 组大鼠病变心肌 TLR4 mRNA 的相对表达水平( 0.430.03) 明显降低( p0.05 )。(图 2, 表 3)Line 1-3: 假手术组; Line 4-6: 缺血再灌注组; Line 7-9: 缺血预适应组.图 2 各组大鼠病变心肌 TLR4蛋白表达情况表 3 各组大鼠血清TLR4 蛋白相对表达水平( s , n=3 )x组别 TLR4 /-actin假手术组 0.190.02缺血再灌注组 0.670.02 a缺血预适应组 0.430.04 a, b注: a p0.01 vs. 假手术组; b p0.01 vs. 缺血再灌注组3. 讨论早
25、在上世纪30年代末 Mallory等人就报道在急性心肌梗死猝死的病人尸检中发现心肌组织的炎症浸润。70年代末期, 溶栓疗法应用于临床后, 人们逐渐认识到再灌注本身也可以引起心肌的损伤, 随着对心肌缺血-再灌注损伤研究的深入, 越来越多的证据显示了以中性粒细胞浸润为主的炎症是造成心肌再灌注损伤的重要机制之一。另外致炎因子、炎性介质及其介导的炎症反应在心肌缺血/再灌注损伤的机制中具有重要地位。心肌缺血能够引起急性炎症反应, 而再灌注后加剧炎症反应, 可以导致不可逆细胞损伤, 如: 能量代谢障碍、细胞内钙超载、细胞结构丢失以及细胞膜的破裂等。越来越多的证据表明包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介-6
26、(IL-6)等在内的致炎症细胞因子参与了IR 9,10 ,使得炎症与心肌缺血-再灌注损伤的关系日益受到重视。TLR4 是第一个被鉴定的人类 Toll 样受体，是机体识别细菌 LPS 的模式识别受体。广泛地表达在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及上皮细胞和内皮细胞等 CD14 阳性细胞上。在最近的研究中发现, TLR4 参与了 MIR 的发病过程，且在其中发挥着重要的作用 11-13 。 Junichi 等 13发现，相对于野生型小鼠，两种TLR-4 缺陷型小鼠 C57/BL10 ScCrt 和 C3H/HeJ, 再灌注后心肌梗死面积明显减小，且在再灌注后血清 IL-12、IFN- 和 LPS 的
27、含量并没有升高; 这一结果在Akira 等 12 实验中进一步得到证实。在后续实验，Fang13等发现，对 TLR-4 缺陷型小鼠的保护作用是由磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)依赖机制所介导的。该实验结果同样也显示，相对于野生型小鼠, TLR-4 缺陷型小鼠心肌梗死面积明显减小。在 Toll 受体信号相关下游通路研究中发现，许多细胞活性因子的合成和表达是由激活的核转录因子(NF-B)调节的 13。IP 作为一种对抗心肌缺血、缺血再灌注损伤的内源性保护形式, 其具体作用机制尚未阐明。在本研究中, 我们检测了 IPC 对 RI 大鼠模
28、型 TLR4 及相关的致炎细胞因子 TNF-、IL-1 的影响, 试图阐明其对于 RI 可能的作用机制。结果发现, RI 大鼠中 TLR4 无论在 mRNA 还是蛋白水平上均出现明显上调, 该结果与 Yang 7 等研究结果一致。同时, 我们观察到 IPC 可使 TLR4 mRNA 和蛋白水平均出现下调, 并且还降低了外周血血清中致炎细胞因子 TNF-、IL-1 的表达。目前认为 TLR4 通过其 TIR 结构域进行胞内信号转导。TLR4 可通过 IRAK 与肿瘤坏死因子相关因子TRAT6（tummor necrosis factor-associated factor 6）等信号途径激活 N
29、F-B，同时 JNK、P38等 MAP 激酶与 PI-3K 激酶也被激活，进而活化 AP-1(activating protein-1)等转录因子，从而调节IL-1、IL-6、IL-8 等细胞因子，黏附分子和炎症因子的的转录表达，进而影响免疫与炎症反应 14。1 2 3 4 5 6 7 8 9 TLR4-actin60 KD43 KD据此, 我们认为IP 可能影响了该信号通路中的某一个环节而抑制TLR4 及Toll 信号通路中的关键信号分子及其下游效应分子的表达, 从而影响致炎细胞因子如TNF- 和IL-1 的释放, 从而产生心肌保护作用。近年来研究也证实, 心肌缺血和再灌注时产生的氧自由基可
30、激活NF-B 15 , TNF- 作用于相应的受体后也可通过第二信使Cer (神经酰胺)等激活NF-B 16 。NF-B是激活后与 IB 解体而进入细胞核, 调节相应基因 ( ICAM-1等) 表达, 使细胞粘附因子得以合成与表达, 进而使中性粒细胞粘附于血管内皮细胞, 正是这种细胞因子的级联反应造成心肌组织损伤。通过研究IPC 对TLR4 的影响不仅有利于对心肌缺血的病理生理过程的理解, 而且为临床探索防治心肌缺血再灌注提供了新的思路和潜在的药物作用靶点, 其具体作用机制值得进一步探讨。参考文献1 Murry CE , Jennings RB , Reimer KA. Preconditio
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